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本文聚焦细菌癌症疗法，研究发现表达穿孔素 O（PFO）的非致病性大肠杆菌在治疗中会出现突变逃逸问题。通过构建数学模型，证实动态调控基因表达策略可缓解该问题，为优化细菌癌症治疗提供了重要依据，推动该领域发展。
### 细菌癌症疗法的研究背景
随着合成生物学的飞速发展，基因工程细菌作为癌症治疗的新选择崭露头角。工程菌能利用肿瘤微环境的特点，定植于肿瘤缺氧区域并释放治疗分子。在设计细菌癌症疗法时，需考虑两个关键因素：一是选择合适的治疗分子，二是精准控制细菌在空间和时间上释放治疗分子。
细菌孔形成毒素（PFTs）中的穿孔素 O（PFO）备受关注，它能高效杀死癌细胞。研究人员利用酰基高丝氨酸内酯（AHL）诱导型启动子（PluxI）控制大肠杆菌表达 PFO，发现 PFO 通过裂解细菌载体释放，且裂解具有引发免疫反应和控制工程菌生长的优势，但也可能导致编码裂解触发蛋白的基因出现非功能性突变。
材料与方法
- 实验材料准备：实验选用大肠杆菌 MG1655 作为宿主菌株，将其转化为携带表达 PFO 的质粒 pTD103_theta 和表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒。在培养细菌时，使用含适当抗生素的溶原肉汤（LB）培养基，在特定条件下培养。
- 实验方法与检测手段：采用多种实验方法，如利用酶标仪测定细菌生长曲线、通过测序检测突变体、使用 MTT 法检测细胞活力等。还制作了母机（mother - machine）进行细菌培养和分析，运用分子动力学模拟研究蛋白质结构变化，构建常微分方程（ODE）模型描述细菌群体动态变化。
实验结果
- 大肠杆菌表达 PFO 用于癌症治疗的效果：在微流控装置中，添加 100 nM AHL 诱导 PFO 表达后，观察到细菌细胞明显裂解，细菌数量减少。酶标仪实验也显示，随着诱导时间增加，细菌光密度（OD600）先升高后降低。收集细菌培养上清液培养小鼠结肠癌细胞系 CT26，发现癌细胞活力随毒素表达诱导时间延长而降低，表明大肠杆菌表达的 PFO 可作为溶菌驱动的细菌癌症疗法。
- 治疗细菌的突变逃逸和种群瓶颈：长时间诱导 PFO 表达会导致治疗细菌出现种群瓶颈，非裂解性突变体逐渐取代原始治疗细菌。测序结果显示，经 AHL 诱导培养的细菌中，多个菌落的 pfo 基因发生突变，如出现 D397N 错义突变和移码突变。分子动力学模拟表明，D397N 突变导致 PFO 蛋白结构和运动性改变，使其无法有效裂解大肠杆菌内膜。
- 种群瓶颈的建模：构建数学模型描述治疗细菌和突变体种群的演化。该模型考虑了毒素诱导的裂解率、毒素产生率、细菌生长率等因素，通过拟合实验数据验证了模型的有效性。模型可用于预测不同诱导条件下细菌种群的变化，为优化治疗策略提供理论依据。
- 毒素产生的动态控制：实验与计算预测：长时间静态诱导毒素表达会使治疗细菌被非裂解性突变体取代，导致治疗分子储备丧失。实验通过测量 GFP 荧光强度来间接衡量毒素释放量，发现诱导时间与释放的治疗负荷和突变体比例存在权衡关系。模拟结果表明，动态诱导策略（短时间重复诱导）可在突变体接管前释放更多治疗毒素，缓解突变逃逸的影响。
讨论
在设计基因工程细菌用于临床应用时，需考虑合成基因电路对细菌代谢的影响以及突变逃逸问题。此前研究多聚焦于优化基因设计提高稳定性，而本研究提出动态诱导基因表达的策略来缓解突变逃逸。该策略可通过多种方式实现，如基于群体感应的基因电路、光遗传学模块等。
对于临床转化中突变体占主导的问题，可通过设计细菌的衰减机制增强免疫系统清除、利用细菌在体内较长的倍增时间以及参考监管机构对突变体的允许限度来解决。此外，细菌癌症疗法还面临脱靶积累和毒性等问题，目前正在探索通过调节细菌免疫原性等策略来解决。结合细菌疗法设计和计算生物学的 “网络遗传学（cybergenetics）”，有助于更深入理解生物噪声对治疗可靠性的影响，推动细菌癌症疗法向体内和临床应用发展。
