解脂耶氏酵母代谢工程合成萜类化合物：进展、策略与展望

这篇综述聚焦解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）合成萜类化合物的研究。阐述其作为宿主的优势，介绍合成生物学工具，总结代谢工程策略，探讨面临的挑战与潜在解决方案，为萜类化合物合成的研究与应用提供重要参考。

　　

解脂耶氏酵母用于萜类合成的研究背景

萜类化合物是以异戊二烯（C₅H₈）为基本结构单元的天然次生代谢物，根据碳原子数可分为半萜（C₅）、单萜（C₁₀）等多种类型。它在植物中参与信号传导等重要生理过程，在医药领域，因其抗炎、抗肿瘤等生物活性备受关注。目前，获取萜类化合物的传统方法，如植物提取和化学合成，存在诸多弊端，前者植物生长周期长、提取过程复杂，后者成本高且不环保。

随着合成生物学发展，利用微生物细胞工厂合成萜类成为新兴方法。萜类合成主要通过甲羟戊酸（Mevalonate，MVA）途径（真核生物）和甲基 - D - 赤藓糖醇 - 4 - 磷酸（Methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途径（原核生物）。解脂耶氏酵母作为非常规产油酵母，在萜类合成研究中崭露头角。

解脂耶氏酵母：萜类合成的理想宿主

在微生物合成萜类的研究中，大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和解脂耶氏酵母都有应用。但大肠杆菌缺乏内膜系统，限制了膜锚定蛋白的表达。相比之下，酵母等真核微生物在复杂蛋白质合成和生物活性物质生产方面更具优势。

解脂耶氏酵母具备多种优势，它能耐受盐、低温和低 pH 环境，可利用葡萄糖、废食用油和甘油等多种底物生长。其高通量的三羧酸循环（TCA）为萜类合成提供丰富的乙酰辅酶 A（acetyl-CoA），大量的脂滴和亚细胞结构为疏水产物提供储存位点，且戊糖磷酸途径（PPP）活跃，能提供合成所需的 NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。此外，它遗传背景清晰，拥有高效的基因编辑工具。基于这些优势，多种萜类化合物已在解脂耶氏酵母中成功合成，部分产物如反式橙花叔醇、α - 法呢烯等达到较高产量。

解脂耶氏酵母基因编辑的关键元件

1. 启动子：启动子在转录水平调控基因表达，对维持细胞生长和提高目标萜类产量至关重要。目前已鉴定出多种解脂耶氏酵母的启动子，包括与脂质代谢相关的内源性启动子，其表达强度存在差异。此外，还有通过融合上游激活序列（UAS）和核心启动子序列构建的杂交启动子，以及诱导型启动子等，可满足不同的基因表达需求。
2. 终止子：终止子是转录过程中的重要调控元件，影响 mRNA 的稳定性。常用的内源性终止子有 CYC1t、XPR2t 和 LIP2t 等。人工终止子序列较短且更有效，还能降低自然终止子再利用引发的同源重组风险。
3. 选择标记：解脂耶氏酵母常用的筛选标记有营养缺陷型标记（如 LEU2 和 URA3）和抗生素抗性基因。营养缺陷型标记使用时可能影响脂质合成，而 URA3 可利用 5 - 氟乳清酸（5 - FOA）进行回收。同时，敲除乙酰胺酶基因（AMD1）的菌株可在特定氮源培养基上筛选。抗生素抗性基因如潮霉素 B 和诺尔斯菌素抗性基因，弥补了营养缺陷型标记数量有限的不足，还可用于构建 Cre/loxP 重组系统，实现基因整合、表达和标记回收。

解脂耶氏酵母的基因表达策略

1. 基于游离质粒的基因表达：目前尚未发现解脂耶氏酵母的天然游离质粒，研究人员构建了人工游离质粒。自主复制序列（ARS）对人工游离质粒构建至关重要，它包含复制起点（ORI）和着丝粒（CEN）。解脂耶氏酵母中有 ARS1、ARS2 等 4 种主要的 ARSs。然而，质粒表达载体存在拷贝数和稳定性低的问题，不利于异源基因稳定表达。
2. 基于基因组整合的基因表达：基因组整合是维持基因稳定表达的常用方法。解脂耶氏酵母中 DNA 整合主要有同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两种方式，NHEJ 是其修复 DNA 双链断裂（DSBs）的首选方式，而 HR 在酿酒酵母中更常用。提高解脂耶氏酵母 HR 效率的方法包括增加同源臂长度，敲除负责 NHEJ 的KU70和KU80基因，或过表达 RAD52 超家族等相关基因。此外，还有基于 Cre/loxP 系统、26S 核糖体 DNA（rDNA）位点、长末端重复序列（LTRs）和 rDNA 序列以及机器学习等多种基因整合策略，CRISPR/Cas9 系统的应用也实现了快速基因编辑。

解脂耶氏酵母工程中萜类积累的策略

1. MVA 途径工程
   • 增强 HMGR 表达：羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶（HMGR）是 MVA 途径的限速酶，过表达该酶可促进萜类积累。但全长 HMGR 和 N 端截短的 HMGR（tHMGR）对不同萜类合成的影响存在差异，tHMGR的效果尚不明确。
   • 优化 ERG20 表达：法呢基焦磷酸合酶（Erg20）对法呢基焦磷酸（FPP）生成至关重要，过表达该酶可促进萜类合成。ERG20 与倍半萜合酶（STS）基因的融合表达能提高萜类产量，且不同STSs的最佳融合顺序不同。此外，构建ERG20突变体可改善单萜合成。
   • 过表达其他 MVA 途径基因：除 HMGR 和 ERG20 外，过表达 MVA 途径的其他基因，如ERG13、异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）等，或同时过表达 MVA 途径的所有基因，都能增加萜类合成的代谢通量。
   • 下调竞争途径：以 FPP 为前体合成角鲨烯等萜类时存在底物竞争，为提高目标产物代谢通量，常采用下调角鲨烯合酶基因（ERG9）表达的策略，如使用弱启动子替换或截断其天然启动子，但不能敲除该基因，因为角鲨烯是细胞膜成分麦角甾醇的前体，对细胞生长至关重要。
   • 引入异源途径或基因：引入异源途径或酶可增加萜类产量，如引入异戊烯醇利用途径可提高 IPP 和 DMAPP 含量，过表达来自其他物种的与 MVA 途径合成相关的基因也能促进萜类合成。
2. 增加乙酰辅酶 A 供应
   • 增强内源性途径：激活腺苷一磷酸脱氨酶（AMPD）表达可抑制异柠檬酸脱氢酶活性，使柠檬酸积累，经线粒体柠檬酸载体 YHM2 转运至细胞质，再由 ATP - 柠檬酸裂解酶 ACL 转化为乙酰辅酶 A，促进萜类合成。此外，减少脂质合成、增强 β - 氧化也能增加细胞质中乙酰辅酶 A 的积累。
   • 引入异源乙酰辅酶 A 合成途径：除内源性途径，引入异源细胞质乙酰辅酶 A 积累途径也可促进萜类生产，如磷酸酮醇酶（PK） - 磷酸转乙酰酶（PTA）途径，但该途径对不同萜类合成的效果存在差异。
3. 平衡辅因子代谢：辅因子在细胞代谢中发挥重要作用，MVA 途径需要大量 NADPH。通过过表达 PPP 途径中的葡萄糖 - 6 - 磷酸脱氢酶和 6 - 磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（ZWF1和GND），或表达依赖 NADP⁺的苹果酸酶（如McMAE），可增加 NADPH 供应。此外，过表达依赖 NADH 的 HMGR 基因（如SpHMGR），可驱动碳通量进入 MVA 途径，减少对 NADPH 的依赖。
4. 利用亚细胞结构
   • 过氧化物酶体中代谢途径的区室化：过氧化物酶体是 β - 氧化的场所，通过将萜类合成途径定位到过氧化物酶体，可减少底物竞争，提高萜类产量。例如，构建过氧化物酶体中 α - 葎草烯和反式橙花叔醇的合成途径，产量均有显著提高。
   • 线粒体中代谢途径的区室化：线粒体 TCA 循环通量高，可为萜类合成提供前体。将合成途径整合到线粒体中，可大幅提高 β - 甜没药烯的产量。
5. 通过脂质生物合成工程提高萜类积累：萜类等亲脂性化合物存储在脂质体中，调节脂质含量可影响萜类产量。过表达DGA1可增加脂质积累，提高 β - 甜没药烯产量，但过多的乙酰辅酶 A 用于脂质积累也会抑制萜类生物合成。相反，敲除负责脂质合成的DGA1和DGA2基因，可提高 α - 法呢烯产量。

解脂耶氏酵母生产萜类面临的挑战与解决方案

虽然解脂耶氏酵母在萜类合成方面取得一定成果，但仍面临挑战。基因编辑技术虽有进展，但与酿酒酵母等模式生物相比，HR 效率仍有待提高，需开发更高效的基因编辑工具。

优化菌株蛋白质折叠效率也是未来构建萜类细胞工厂的潜在策略。构建萜类细胞工厂时，大量蛋白质表达增加内质网负担，影响蛋白质折叠效率。调节酵母细胞中未折叠蛋白反应（UPR）相关转录因子（如 HAC1）的表达，可提高蛋白质折叠和构象修饰效率，助力微生物细胞工厂建设。

优化碳源利用是合成生物学的新兴研究方向，对可持续发展战略实施具有重要意义。使用木糖、甲醇等非食品类碳源的研究日益受到关注。

此外，利用基于转录因子或激素的动态调控系统对产物生产进行动态调控，可实现高效筛选。例如，通过调控亮氨酸生物合成筛选柚皮素生产菌株。对于萜类生产，综合运用多种策略可提高产量，但不同策略对不同产品效果各异。未来，基因组规模的代谢网络建模有望为萜类积累提供通用策略。