超声控释药物：阻击肝癌残留肿瘤，扭转免疫微环境新策略

本文构建了基于中性粒细胞（NEs）的药物递送系统用于治疗射频消融（RFA）后残留肝癌。研究发现 RFA 会使 NEs 向促瘤表型转变影响疗效，而超声控释可避免此转变，维持炎症微环境，增强对残留肿瘤的治疗效果，为肝癌治疗提供新思路。

　　

一、研究背景

原发性肝癌全球发病率位居第六，是癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌（HCC）占肝癌的 75%-85%。射频消融（RFA）是治疗 HCC 的主要根治方法，有安全、简单、不良反应少和住院时间短等优势，但由于肿瘤结构复杂、边界不清等问题，会导致不完全射频消融（IRFA）和残留肿瘤形成，HCC 经 RFA 治疗后的局部复发率在 2%-36%，复发肿瘤恶性程度更高，对传统化疗敏感性低，预后差。

利用内源性白细胞进行靶向药物递送是一种有潜力的策略。NEs 占循环白细胞的 50%-70%，是对炎症反应迅速的初始免疫细胞，可作为细胞药物载体将药物递送至炎症相关疾病部位，如术后炎症部位的残留肿瘤。然而，尚不清楚 NE 药物载体在自发和外源性刺激诱导下的药物释放效率和治疗效果是否存在差异。

此前研究表明，RFA 后炎症细胞浸润到残留肿瘤会引发免疫反应，但随后会出现免疫抑制微环境。肿瘤细胞与免疫微环境相互作用，肿瘤相关中性粒细胞（TANs）浸润肿瘤环境可能转变为促瘤表型，促进肿瘤进展。目前尚不确定免疫抑制性肿瘤微环境（TME）是否会诱导 NE 载体发生表型转变并影响治疗效率。

二、材料和方法

1. 细胞系和细胞培养：肝癌细胞系（HepG2、HCC-LM3 和 H22）购自中国科学院细胞库，分别在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素双抗的 DMEM 或 RPMI 1640 培养基中，于 5% CO₂、37°C 的湿润环境中培养。
2. NEs 的分离：采用 Percoll 梯度法从小鼠骨髓中分离 NEs，通过离心、重悬等操作获取骨髓细胞，再经不同浓度 Percoll 溶液分层，从 78% 和 65% 界面收获 NEs，用流式抗体检测纯度，评估药物负载能力。
3. ZDP（ZIP）和 NZDP（NZIP）的制备：先将硝酸锌六水合物和二甲基咪唑分别溶解，加入阿霉素（DOX）或吲哚菁绿（ICG）溶液，再混合反应，经离心、真空冷冻干燥得到 DOX@ZIF-8（ZD）或 ICG@ZIF-8（ZI）纳米颗粒（NPs）。在真空条件下向 ZD 或 ZI 粉末中注入全氟己烷（PFH）得到 PFH/DOX@ZIF-8（ZDP）或 PFH/ICG@ZIF-8（ZIP）NPs，将分离的 NEs 与 ZDP 共孵育 1 小时得到 NZDP。
4. 表征：运用透射电子显微镜（TEM）、X 射线衍射（XRD）、紫外 - 可见光谱（UV-vis）、激光纳米仪（测 zeta 电位）、共聚焦激光扫描显微镜等对 NPs 进行表征。
5. US 控制 DOX 从 NZDP 释放：振荡 NZDP 溶液，定时取样，用 UV-vis 分光光度计测定上清液中 DOX 含量。
6. NZDP 的体内 US 增强成像：给荷瘤小鼠 IRFA 后静脉注射 NZDP 或 PBS，注射后用 US 照射肿瘤部位，记录照射前后 B 超和对比增强超声（CEUS）图像。
7. 细胞活力测定：使用 Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测 NE 或肿瘤细胞活力，将细胞接种于 96 孔板，分别用不同处理组处理，培养后用多功能读数仪测 450nm 处吸光度计算细胞活力。
8. NZDP 的体外固有趋化性：通过 Transwell 迁移实验，将 NEs 或 NZDP 接种于上室，下室加入不同浓度肿瘤坏死因子 -α（TNF-α），染色并计数迁移细胞，计算趋化指数。
9. NZDP 的体内固有趋化性：建立 IRFA 皮下肿瘤模型，用体内成像系统记录 NZDP 的炎症靶向能力，对荷瘤小鼠进行不同处理后注射 NZIP，在不同时间点成像。
10. 药物在三维肿瘤球体中的渗透性：将 H22 细胞接种于低粘附 6 孔板培养成肿瘤球体，与 DOX、ZDP 或 NZDP 孵育 8 小时，用共聚焦激光扫描显微镜成像。
11. 荷瘤小鼠的建立：选取 4-5 周龄健康 BALB/c 裸鼠，适应性饲养 1 周后皮下注射 H22 细胞，待肿瘤体积长至 600-800mm³时进行 IRFA。
12. IRFA 小鼠模型的建立：麻醉小鼠，消毒皮肤，在超声引导下将射频针插入肿瘤长轴约三分之一处，设定射频发射器功率和时间，术后观察小鼠情况。
13. 体内治疗效果：IRFA 处理后的小鼠在术后第 1 天和第 3 天分别给予不同处理（PBS、DOX、NZDP、NZDP+US），记录肿瘤体积，14 天后采集血液样本进行生化检测，取重要器官染色。
14. 凋亡检测：将 NEs 与未加热肿瘤细胞和亚致死加热肿瘤细胞的上清液共孵育不同时间，用 annexin V-FITC 和 PI 溶液染色，通过流式细胞术检测凋亡率。
15. 统计分析：每个实验独立重复 3 次，定量数据以均值 ± 标准差表示，用 GraphPad Prism 7.0 进行统计分析，根据数据情况选择合适的检验方法，P<0.05 为差异有统计学意义。

三、研究结果

1. IRFA 促进 TANs 向促瘤表型转变并诱导免疫抑制性 TME：建立 IRFA 小鼠模型发现，IRFA 显著促进 NEs 浸润到残留肿瘤。分离纯化 NEs 后与亚致死加热 HCC 细胞上清液共孵育，发现 NEs 形态更多变为纺锤形，凋亡延迟，分泌的免疫抑制细胞因子增加，CD80⁺NE 比例降低，CD206⁺NE 比例升高，体内实验也得到类似结果，表明 IRFA 后残留肿瘤细胞促使 NEs 发生促瘤表型转换，增加免疫抑制微环境的形成。
2. NZDP 的制备和表征：构建以 NEs 为载体的药物递送系统 NZDP，ZD 的 UV-vis 光谱显示 DOX 成功负载，TEM、XRD 等表征证实 NPs 的成功制备和结构特征。NZDP 对 NEs 毒性低，药物负载率高，在无超声处理时 8 小时内 DOX 释放少，超声处理后立即完全释放。
3. NZDP 的 US 成像：ZDP 在加热或超声处理后会产生气泡，NZDP 在体外和体内超声成像实验中，超声处理后信号强度显著增强，且在未超声处理时稳定，表明 NZDP 可作为有效的超声成像剂，引导肿瘤区域药物的超声控释。
4. NZDP 的固有趋化性和最佳渗透性增加其在 IRFA 后残留肿瘤处的药物积累：IRFA 上调残留肿瘤部位 TNF-α 和 IL-6 水平，Transwell 迁移实验表明 NZDP 对 TNF-α 的趋化性呈浓度和时间依赖性，与 NEs 相当。三维肿瘤球体模型显示 NZDP 的肿瘤渗透性优于 DOX 和 ZDP，体内实验发现 NZDP 能在残留肿瘤部位有效积累，增强药物积累，提高治疗效果。
5. US 控制 NZDP 释放增强体外抗肿瘤细胞疗效：超声照射可使 PFH 发生液 - 气相变，促使 NE 载体破裂释放药物。超声处理后，NZDP 中 DOX 释放率显著提高，对 HCC 细胞增殖抑制作用增强，活 / 死细胞双染显示超声处理后的 NZDP 清除 HCC 细胞的效果更好。
6. US 控制 NZDP 释放增强 IRFA 后抗残留肿瘤疗效：体内实验表明，NZDP 联合超声处理抑制肿瘤生长的效果优于 NZDP 单独处理，且具有良好的生物相容性。TUNEL 分析和 caspase-3 染色显示联合处理组肿瘤细胞凋亡增加。
7. US 控制 NZDP 释放防止 NE 载体的促瘤表型转变并提高顺序靶向效果：体外实验发现药物负载的 NE 载体与亚致死加热 HCC 细胞上清液共孵育后发生促瘤表型转变，而 NZDP 联合超声处理能维持残留肿瘤区域的炎症反应，提高 TNF-α 水平，增强后续 NZDP 的靶向效率，有效避免 NE 载体的促瘤表型转变，提高治疗效果。

四、研究结论

本研究构建了能进行超声成像和时空可控药物释放的 NE 介导药物递送系统，用于治疗 IRFA 后残留肿瘤。首次发现 IRFA 诱导的免疫抑制微环境会使 TANs 和 NE 载体向促瘤表型转变，影响治疗效果。利用超声触发药物释放可避免 NE 载体的这种转变，维持炎症微环境，提高顺序靶向效果，增强对 IRFA 后残留肿瘤的治疗。该研究为理解微环境对 NE 介导药物递送系统的影响提供新视角，对其他免疫细胞药物递送系统也有借鉴意义，即通过外部刺激快速释放药物可预防潜在不良影响。