异丙肾上腺素修饰聚乙烯亚胺：靶向哮喘治疗与抑制气道重塑的高效基因递送系统

本文介绍了一种新型基因递送系统（PEI–异丙肾上腺素）。通过体外和体内实验，验证其生物相容性、转染效率高，能有效抑制精氨酸酶 - 1（ARG1）基因表达，减轻气道炎症和纤维化，有望为哮喘治疗及气道重塑研究带来新突破。

　　

研究背景

哮喘是一种常见的慢性支气管炎症性疾病，其特征为对多种刺激产生过度的支气管收缩反应，导致可逆性支气管痉挛。潜在的病理生理过程包括持续的气道炎症，多种细胞如嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞浸润其中。这种炎症会引发气道高反应性，使气道在轻微刺激下收缩，最终导致症状出现。尽管气道通常在收缩后恢复原状，但反复发作会导致气道壁增厚，进而发展为慢性哮喘。气道平滑肌层的重塑会表现为呼吸困难和哮喘休克。

气道重塑与哮喘的严重程度及治疗药物的疗效密切相关。目前哮喘的治疗主要依赖缓解药物和控制药物。异丙肾上腺素是首个合成的 β - 激动剂，是一种高效的支气管扩张剂，也用于治疗心动过缓和心脏传导阻滞。然而，现有治疗方法对控制哮喘，尤其是存在气道重塑的患者可能不足，甚至会导致不可逆的气道狭窄，危及生命。

精氨酸酶 - 1（ARG1）在过敏性哮喘中起着关键作用，在哮喘中辅助性 T 细胞 2（Th2）介导的免疫反应异常激活时，ARG1 会过度表达。在正常生理状态下，ARG1 将 L - 精氨酸水解为 L - 鸟氨酸和尿素。但在哮喘中，作为 Th 免疫反应的细胞因子，ARG1 在肺组织气道的上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞中高表达，促进气道组织重塑。ARG1 的表达与气道平滑肌收缩增加有关，可能会降低一氧化氮（NO）生成所需的精氨酸可用性，导致 NO 水平降低，进而加剧气道高反应性。此外，ARG1 还与气道中胶原蛋白沉积和纤维化增加有关，其活性升高可促使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，加剧细胞外基质成分的产生，促进气道重塑。同时，ARG1 活性还与气道黏液分泌调节有关，其表达升高会导致杯状细胞增生，引起过多黏液分泌，这是哮喘气道重塑的特征之一，也是气道阻塞的原因之一。在免疫反应中，ARG1 在巨噬细胞极化中发挥作用，表达高水平 ARG1 的 M2 巨噬细胞与组织修复和重塑相关，而巨噬细胞极化失衡会导致哮喘中的慢性炎症和重塑。因此，ARG1 是哮喘潜在的治疗靶点。

材料和方法

1. PEI–异丙肾上腺素的合成：采用两步共轭反应合成 PEI–异丙肾上腺素，第一步将氯甲酸乙酯、马来酰亚胺丙酸溶解在四氢呋喃和三乙胺中，加入异丙肾上腺素搅拌过夜，通过旋转蒸发去除溶剂，经硅胶柱色谱纯化。第二步将马来酰亚胺丙酸异丙肾上腺素与 PEI 在甲醇中混合孵育过夜，透析去除未结合的异丙肾上腺素衍生物。
2. siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物的制备：设计小鼠 ARG1 siRNA 序列，将其与 PEI–异丙肾上腺素按不同重量比混合孵育。为跟踪转染效率，对 siRNA 进行氰基 5（Cy5）标记，并去除未结合的染料。
3. ARG1 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物形成的确认：利用琼脂糖凝胶电泳、动态光散射和扫描电子显微镜（SEM）评估复合物的形成。将 ARG1 siRNA 和 PEI–异丙肾上腺素按不同重量比混合，进行琼脂糖凝胶电泳；用 Zetasizer Nano ZS 系统分析混合物的平均大小和 zeta 电位；通过 SEM 观察复合物的形状和大小。
4. β2 - 肾上腺素能激动剂亲和力的测量：使用 PathHunter eXpress ADRB2 G 蛋白偶联受体（GPCR）检测试剂盒评估异丙肾上腺素和修饰后的异丙肾上腺素（PEI–异丙肾上腺素）与 β2 肾上腺素能受体（ADRB2）的结合亲和力。将 THP - 1 细胞（表达 ADRB2）接种于 96 孔板，加入不同浓度的异丙肾上腺素和 PEI–异丙肾上腺素孵育，再加入检测试剂孵育，用酶标仪读取结果。
5. 肝素竞争试验：为评估 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物的稳定性，进行肝素竞争试验。将 siRNA 与 PEI–异丙肾上腺素混合孵育后，加入不同量的猪肝素钠盐，再次孵育，最后用 1.3% 琼脂糖凝胶电泳分析混合物。
6. MTT 细胞毒性试验：使用 3 -（4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基）- 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐（MTT）试验测定 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物在 Beas2B 细胞中的细胞毒性。将 Beas2B 细胞接种于 24 孔板，孵育 72 小时后加入 MTT 试剂，再孵育 4 小时，溶解甲臜晶体，测量吸光度，计算细胞活力。
7. siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物的转染：将 THP - 1 细胞接种于 24 孔板孵育 24 小时，设置阳性对照（Lipofectamine 与 siRNA 混合），准备三组转染样品：Cy5–siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物、裸 Cy5–siRNA、Cy5–siRNA/Lipofectamine 复合物。将样品加入细胞孔中孵育 8 小时，洗涤、固定、染色后，用荧光显微镜观察细胞荧光。
8. 动物模型：通过 51 天的致敏和气道激发，在小鼠中诱导慢性气道炎症。对野生型 BALB/c 小鼠进行腹腔注射卵清蛋白和氢氧化铝进行过敏致敏，之后通过鼻内注射卵清蛋白进行激发。将 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物和裸 siRNA 经气管内给药，同时给予 Cy5 荧光标记的 siRNA。所有动物实验方案均获得汉阳大学机构动物护理和使用委员会的批准。
9. mRNA 水平分析：使用 RNAiso RNA 分离试剂提取小鼠肺组织的总 mRNA，合成互补 DNA，进行逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）。使用特定的引物序列扩增小鼠 ARG1 和内参基因甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH），通过 1.3% 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。
10. 支气管肺泡灌洗液分析：通过气管插入导管收集支气管肺泡灌洗液（BALF），离心浓缩细胞，进行免疫细胞化学染色以确认注射 siRNA 的分布，用 Diff - Quik 染色观察病理细胞变化，在光学显微镜下计数巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
11. 动物模型肺组织组织学：处死哮喘模型小鼠后，收集肺组织，固定、包埋、切片。进行免疫分析时，对切片进行脱蜡、复水、封闭等处理，使用抗 ADRB2 抗体和荧光标记的二抗，用 DAPI 染色后在荧光显微镜下观察。通过 Masson 三色染色评估胶原蛋白水平，用 ImageJ 进行定量分析，同时进行苏木精和伊红染色观察肺组织的病理气道状况。
12. 乙酰甲胆碱试验：由顺天乡大学富川医院内科进行乙酰甲胆碱试验，评估动物模型的气道高反应性。设置健康正常对照组、卵清蛋白激发的哮喘模型组、异丙肾上腺素治疗组、PEI–异丙肾上腺素复合物治疗组、ARG1 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物治疗组。在药物治疗 1 小时后进行乙酰甲胆碱激发并测量增强暂停（Penh）值。
13. 统计学分析：数据以三次重复实验的平均值 ± 标准差表示，使用 SPSS 27 进行统计分析。组间比较采用 Kruskal–Wallis 检验，若存在显著差异，再用 Mann–Whitney U 检验和 Tukey 事后检验进行进一步的两两比较，P < 0.05 被认为具有统计学意义。

研究结果

1. PEI–异丙肾上腺素复合物的鉴定和表征：成功合成 PEI–异丙肾上腺素，其合成过程和化学结构经确认。基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱分析表明，PEI–异丙肾上腺素的分子量分布与 PEI2K 相似，但大小偏移约 1100 Da，推测每个 PEI 分子结合约 3 个异丙肾上腺素分子。ADRB2 GPCR 检测显示，PEI–异丙肾上腺素与异丙肾上腺素对 ADRB2 的亲和力无显著差异，IC₅₀值分别为 35.34 ± 2.42 nM 和 38.49 ± 2.14 nM。
2. siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物的表征：凝胶阻滞试验确定 siRNA 与 PEI–异丙肾上腺素的最佳重量比为 1:5，此时复合物形成稳定结构。随着载体量增加，复合物表面电荷显著增加，在 1:5 的重量比下，zeta 电位为 12.08 ± 0.81 mV，粒径为 141.68 ± 8.1 nm，具有较窄的尺寸分布和较小的多分散指数。在肝素条件下，1:10 的重量比时复合物开始解体；在血清中，siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物比 PEI2K 复合物更稳定，表明其适合全身给药。
3. siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物的细胞活力和抑制浓度：MTT 细胞毒性试验表明，在测试浓度下（小于 10^?6 M），异丙肾上腺素、PEI–异丙肾上腺素和 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物对 Beas2B 细胞的细胞毒性无显著差异，说明各测试组在该研究浓度下对细胞耐受性良好。
4. siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物的体外转染：在表达 ADRB2 的 THP - 1 细胞中，PEI–异丙肾上腺素载体的转染效率显著高于传统载体。用 PEI–异丙肾上腺素载体转染时，83% ± 13.7% 的 THP - 1 细胞出现强烈的 Cy5 信号，而用 PEI2K 载体时，只有不到 5% 的细胞出现微弱信号。在不表达 ADRB2 的 Beas2B 细胞中，PEI–异丙肾上腺素载体的 siRNA 递送率为 17% ± 12.3%。预先用异丙肾上腺素处理使受体失活后，基因递送率降至约三分之一，证实 PEI–异丙肾上腺素基因载体通过与 ADRB2 结合实现递送。
5. 体内递送 ARG1 siRNA/PEI–异丙肾上腺素靶向动物 BALF 和肺组织中的 ADRB2 受体：在慢性哮喘小鼠模型中，PEI–异丙肾上腺素载体能高效地将 ARG1 siRNA 递送至表达 ADRB2 的细胞。在 BALF 细胞和肺组织中，PEI–异丙肾上腺素载体的 siRNA 递送率约为 80%，而 PEI2K 载体仅约 20%，表明该新型载体在慢性哮喘和气道重塑研究中具有高效靶向基因递送的潜力。
6. ARG1 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物对 ARG1 的敲低作用：RT - PCR 分析显示，哮喘诱导组 ARG1 基因表达显著升高，而 ARG1 siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物治疗组的 ARG1 基因表达显著降低，比未治疗的哮喘组抑制约 63%，表明该复合物能有效进入靶细胞并干扰上调的 ARG1 基因。
7. siRNA 复合物在慢性哮喘模型中的治疗效果：细胞分析表明，Arg1 siRNA/PEI–isoprenaline 治疗显著减少气道炎症细胞数量，抑制炎症效果优于其他对照组。在气道组织中，该治疗也抑制了炎症细胞浸润、支气管增厚和纤维化。Masson 三色染色显示，Arg1 siRNA/PEI–isoprenaline 组纤维化减少最明显。乙酰甲胆碱试验表明，异丙肾上腺素治疗对气道高反应性的抑制作用最显著，Arg1 siRNA/PEI–isoprenaline 复合物治疗也有抑制作用，但与其他治疗组的差异未达统计学意义。

研究讨论

本研究全面探索了新型 PEI–异丙肾上腺素复合物作为慢性哮喘靶向基因递送载体的潜力。通过鉴定和表征，证实了其成功合成，确定了化学结构和分子结合比例，且 PEI 的连接未显著改变异丙肾上腺素对 ADRB2 的亲和力。siRNA/PEI–异丙肾上腺素复合物在体外实验中展现出良好的稳定性、生物相容性和高效的转染效率，在体内实验中能有效递送 ARG1 siRNA，显著敲低 ARG1 基因表达，减轻气道炎症、纤维化和气道高反应性。Arg1 siRNA/PEI–isoprenaline 治疗在各项指标上优于对照组，表明该新型基因递送系统在慢性哮喘治疗中具有潜在的临床应用价值，有望推动慢性哮喘及相关呼吸道疾病的治疗进展。