机械刺激 3D 复合支架共培养：促进成骨、抑制破骨及诱导 M2 巨噬细胞极化的新策略

本文构建了一种新型 3D 复合支架共培养模型，施加循环单轴压缩。研究发现其可调节成骨与破骨平衡，促进 M2 巨噬细胞极化。该模型无需生长因子，为骨组织工程（BTE）和抗骨质疏松研究提供新方向，值得关注。

　　

一、研究背景

骨组织工程（BTE）是再生医学的前沿领域，3D 打印技术在制备 BTE 支架方面前景广阔。支架材料的选择至关重要，合成可降解聚合物和含纳米羟基磷灰石（nHA）的复合支架备受关注，其中锶（Sr²⁺）等矿物质离子可促进骨愈合。

骨是动态组织，其重塑依赖成骨细胞和破骨细胞的平衡。然而，以往 BTE 构建体的细胞反应评估多在静态条件下进行，忽略了机械刺激的影响。近年来，动态培养条件成为研究热点，不同机械刺激技术可增强前体细胞的成骨分化潜能，调节成骨细胞和破骨细胞的活性。

在骨重塑过程中，免疫调节起着关键作用。巨噬细胞作为主要的免疫调节细胞，有 M1 和 M2 两种极化状态。M1 型巨噬细胞促炎，M2 型巨噬细胞抗炎并促进伤口愈合。机械刺激可影响巨噬细胞极化，但具体机制尚未完全明确。

此外，传统的支架体外评估多采用单培养，无法模拟骨微环境的复杂性。共培养系统可弥补这一不足，但多数共培养需添加刺激剂，影响对细胞间生理通讯的研究。本研究旨在探讨循环单轴压缩对复合支架中细胞的影响以及对巨噬细胞免疫调节的作用。

二、材料和方法

1. 支架合成与灭菌：制备聚 L - 乳酸（PLLA）/ 聚（ε - 己内酯）（PCL）/ 聚（3 - 羟基丁酸酯 - co - 3 - 羟基戊酸酯）（PHBV）聚合物共混物（质量比 90/5/5）与 2.5% Sr - nHA 复合的细丝，用定制的熔融沉积建模打印机打印出 5mm×5mm×1mm 的立方支架，打印前进行两步灭菌处理。
2. 细胞共培养：从健康成人供体获取骨髓样本，分离人骨髓间充质干细胞（hBM - MSCs）和人外周血单个核细胞（hPBMCs），并进行免疫表型鉴定。将 hBM - MSCs 接种到支架上培养 3 天，添加成骨诱导剂培养 10 天，然后接种 hPBMCs，共培养 28 天，期间不添加额外生长因子，设置单培养作为对照。
3. 单轴循环压缩：使用 MCTX 生物反应器对细胞接种的支架施加单轴循环压缩，频率 1Hz，应变 8%，位移 400μm，每天处理 30 分钟，对照组不施加压缩。
4. 细胞相关检测
   • 细胞粘附和形态：通过扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞粘附和形态。
   • 细胞分化的生化测定：检测碱性磷酸酶（ALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性评估细胞分化。
   • 基因表达分析：采用逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）检测成骨和破骨相关基因表达。
   • 细胞因子检测：用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞培养上清液中核因子 κB 受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M - CSF）的分泌水平。
5. 巨噬细胞相关检测
   • 细胞培养和刺激：使用骨髓来源的巨噬细胞（DMBM - 2）细胞，接种到支架上后进行单轴循环压缩刺激。
   • 细胞粘附和形态：通过免疫荧光染色和 CLSM 观察细胞粘附和形态。
   • 免疫组织化学和基因表达分析：检测肿瘤坏死因子 - α（TNF - α）、白细胞介素 - 10（IL - 10）评估巨噬细胞极化，通过 RT - PCR 检测诱导型一氧化氮合酶（iNOs）和精氨酸酶 1（Arg1）基因表达。
6. 统计分析：实验结果以均值 ± 标准差表示，使用 GraphPad Prism 8 软件进行单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验。

三、研究结果

1. 共培养结果
   • 细胞形态和活力：SEM 和 CLSM 结果显示，所有培养条件下细胞活力良好。在 28/14 天，动态共培养中的 hBM - MSCs 呈现成熟的成骨细胞形态，hPBMCs 在单培养中形成多核破骨细胞，在共培养中呈圆形聚集。
   • 成骨和破骨活性：ALP 活性检测表明，动态共培养的 hBM - MSCs 在 28/14 天 ALP 活性最高，促进了成骨。TRAP 活性检测显示，动态培养的 hPBMCs 在 28/14 和 42/28 天 TRAP 活性降低，抑制了破骨。
   • 基因表达：RT - PCR 结果显示，机械刺激上调了成骨标记基因（如 OSN、OSC、OPG、RUNX2）的表达，下调了破骨标记基因（如 DC - STAMP、NFATc1、TRAP）的表达。
   • 细胞因子分泌：ELISA 检测发现，RANKL 和 M - CSF 的分泌受培养条件和时间影响，机械刺激在不同阶段对其分泌有不同作用。
2. 免疫调节结果
   • 巨噬细胞形态：机械刺激不影响巨噬细胞的圆形形态和细胞活力。
   • 巨噬细胞极化：CLSM 检测发现，机械刺激下调 TNF - α 分泌，上调 IL - 10 分泌。基因表达分析表明，机械刺激不影响 iNOs 表达，但显著上调 Arg1 表达，促进 M2 巨噬细胞极化。

四、讨论

本研究建立了一种新型无生长因子的 BTE 动态共培养模型，通过循环单轴压缩刺激 3D 打印的 Sr - nHA 复合支架上的细胞。结果表明，该模型在单培养和共培养条件下均展现出显著的成骨促进和破骨抑制作用，同时增强了巨噬细胞向 M2 表型的极化。

从细胞形态和活力来看，所有培养条件下细胞都能良好生长和增殖，且动态共培养有助于 hBM - MSCs 向成熟成骨细胞分化。ALP 和 TRAP 活性及相关基因表达的变化进一步证实了机械刺激对成骨和破骨过程的调控作用。例如，动态共培养的 hBM - MSCs 在 28/14 天 ALP 活性显著升高，相关成骨基因表达上调；而 hPBMCs 在动态培养下破骨相关基因表达下调，TRAP 活性降低。

在细胞因子方面，RANKL 和 M - CSF 的分泌变化与成骨和破骨过程密切相关。机械刺激虽对 RANKL 分泌影响不明显，但通过上调 OPG 表达，抑制了破骨细胞的形成和活化。对于巨噬细胞，机械刺激通过调节 TNF - α 和 IL - 10 的分泌以及 iNOs 和 Arg1 的基因表达，促进了 M2 巨噬细胞极化，增强了抗炎能力。

综上所述，本研究构建的模型具有很强的抗骨质疏松和抗炎特性，为 3D 支架模型的发展提供了创新思路。后续研究可将该模型应用于动物实验，评估其体内骨再生潜力，还可考虑结合药物递送，进一步提升其在骨质疏松治疗中的应用价值。