生物活性玻璃添加到三氧化矿物凝聚体对牙髓干细胞生物相容性和矿化潜能的影响：为牙髓再生带来新希望

本文研究了生物活性玻璃（BG）添加到三氧化矿物凝聚体（MTA）中对牙髓干细胞（DPSCs）生物相容性和矿化潜能的影响。结果表明，BG 添加不影响 MTA 生物相容性，在模拟体液（SBF）处理下还能增强其矿化能力，为牙髓再生治疗提供了新方向。

　　

研究背景

1993 年三氧化矿物凝聚体（MTA）问世后，钙硅酸盐基水泥在牙髓治疗中地位重要。MTA 具有生物相容性、生物活性和封闭能力等优势，广泛用于牙髓覆盖、根尖填充等牙髓治疗程序，还能促进牙髓干细胞（DPSCs）增殖分化。但它也存在凝固时间长、操作性不便、在血液中物理性能差等缺点。

生物活性玻璃（BG）自 1969 年被发现，能与体液反应促进硬组织缺损区域的骨生成，即骨刺激作用。近年来，BG 作为添加剂用于增强牙科修复材料的再矿化能力。此前研究显示，BG 与 MTA 结合可提高牙本质的推出粘结强度和抗压强度，且不影响 MTA 的成熟反应。本研究旨在评估 BG 添加到 MTA 中对 DPSCs 生物相容性和矿化潜能的影响。

材料和方法

1. 材料制备：人 DPSCs 来自韩国首尔 Cefobio 公司，分离自 6 - 20 岁捐赠者的前磨牙和多生牙。实验分为三组，以白色 ProRoot MTA（美国登士柏西诺德公司）为对照组（MTA），MTA 添加 2% 和 4% 的 63S BG（美国 Bonding Chemical 公司）为实验组（分别标记为 MTABG2 和 MTABG4）。按液粉比 0.3（蒸馏水与粉末）制备直径 10mm、厚度 3mm 的圆盘样本，在 5% CO₂、37°C 培养箱中凝固 24h，之后用 α - 最低必需培养基（α - MEM，美国 GIBCO 公司）提取 7 天，过滤备用。
2. 细胞活力测试：用细胞计数试剂盒 - 8（CCK - 8，日本同仁化学研究所）评估 DPSCs 活力。将 2×10⁴个 DPSCs / 孔接种于 96 孔板，分别在含不同样本洗脱液的培养基中培养 24、48 和 96h，以中间修复材料（IRM，美国登士柏西诺德公司）洗脱液培养的细胞为阴性对照，测量 450nm 处吸光度。
3. 细胞迁移和细胞粘附试验：细胞迁移试验中，将 6×10⁵个 DPSCs / 孔接种于划痕培养皿，形成单层后划伤，加入样本洗脱液培养 24h，用显微镜拍照，ImageJ 软件计算伤口收缩面积。细胞粘附试验在 I 型胶原包被的 96 孔板中进行，加入 5×10⁵个 DPSCs/100μl 样本洗脱液，孵育 1h 后固定、染色，测量 570nm 处吸光度评估粘附细胞数量。
4. 浸泡溶液制备：采用 Tas 描述的 pH7.4 的 Tris（三羟甲基氨基甲烷）模拟体液（SBF），其成分包括 NaCl、NaHCO₃等。样本在 SBF 或蒸馏水中浸泡 2 周，用于扫描电子显微镜（SEM）观察表面形态，或洗脱后用于碱性磷酸酶（ALP）活性测试、茜素红 S（ARS）染色、蛋白质免疫印迹和聚合酶链反应（PCR）。
5. MTA 表面和 DPSCs 形态观察：用 SEM 观察样本表面和 DPSCs 形态及附着情况。样本在 2.5% 戊二醛固定 12h，经梯度乙醇脱水、100% 六甲基二硅胺烷浸泡处理后，溅射镀金 / 钯后观察。
6. MTA 浸泡溶液 pH 变化测量：将样本制成圆盘，初始凝固后紫外线消毒，分别置于蒸馏水和 SBF 中，按特定表面积与体积比准备洗脱液，在 0（基线）、1、2、3、4、12、24 和 48h 测量 pH。
7. BG 添加对 DPSCs 成骨 / 成牙本质分化影响的评估：ALP 活性测试中，样本洗脱后在成骨培养基（OM）中培养 DPSCs 14 天，用 ALP 检测试剂盒测量 ALP 活性。ARS 染色中，样本洗脱后在 OM 中培养 DPSCs 7、14 和 21 天，固定、染色后拍照，ImageJ 软件评估钙化结节面积。RNA 提取和实时定量 PCR（RT - qPCR）中，DPSCs 在 OM 和样本洗脱液中培养 3 和 7 天，提取 RNA、合成 cDNA 后，用特定引物扩增骨形态发生蛋白 - 2（BMP - 2）、ALP、牙本质基质酸性磷酸蛋白 1（DMP - 1）和牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因，以甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，用 2^?ΔΔCt方法评估基因表达。
8. 统计分析：实验独立样本重复三次，至少重复两次。用单因素方差分析和 Tukey 事后检验确定材料间差异，P < 0.05 为有统计学意义，使用 IBM SPSS statistics 29.0.1.0 软件分析。

研究结果

1. 细胞活力：IRM 组细胞活力显著较低（P < 0.05）。所有实验组 24h 样本细胞活力低于 48h 和 96h 样本（P < 0.05）。实验组中不同 BG 浓度组间无显著差异，部分实验组 24h 和 48h 样本细胞活力低于阳性对照组（P < 0.05），但 96h 时各实验组与阳性对照组无显著差异。
2. 细胞迁移和粘附：细胞迁移实验中，各实验组与阳性对照组迁移能力相似，不同 BG 浓度组间无显著差异（P > 0.05）。细胞粘附实验中，MTABG4 组细胞粘附显著高于其他组（P <0.05），MTA、MTABG2 组与阳性对照组无显著差异（P> 0.05）。
3. SEM 观察：MTA 水泥表面覆盖矿化晶体，各实验组 DPSCs 能附着在表面，呈纺锤形成纤维细胞形态。
4. pH 变化：蒸馏水组 pH 从 5.8 升至约 12，SBF 组从 7.4 升至约 8 - 9，随时间 pH 变化略有下降但 48h 内持续上升，蒸馏水组 pH 上升幅度大于 SBF 组，MTA、MTABG2 和 MTABG4 实验组间 pH 无差异。
5. 矿化相关实验结果：ARS 染色显示，随时间染色强度增加，SBF 浸泡组染色更强烈，14 天时所有实验组 BG 浓度增加与钙化结节数量呈正相关，且均多于阴性对照组。ALP 活性测试中，SBF 处理组 MTABG 的 ALP 活性显著高于 MTA（P < 0.01），所有实验组 ALP 活性均显著高于对照组（P < 0.05）。RT - qPCR 分析显示，诱导 3 天后，MTA 和 MTABG 的 BMP - 2 mRNA 水平显著高于对照组，MTABG 的 DSPP 显著高于对照组和 MTA 组；诱导 7 天后，MTA 的 BMP - 2 和 DSPP 表达较高，MTABG 所有检测标记基因（BMP - 2、ALP、DSPP 和 DMP - 1）表达均显著增加。

讨论

再生牙髓治疗要求材料无毒、与牙髓 - 牙本质复合体相容并促进牙本质修复或矿化。MTA 具有生物相容性，BG 能与体液反应释放硅离子促进矿化。本研究发现 BG 添加不干扰 MTA 凝固过程，还增加了成熟过程中羟基磷灰石的形成。

CCK - 8 实验显示 DPSCs 活力随时间增加，24h 时实验组细胞活力低于阳性对照组，可能因 MTA 和 BG 形成的高碱性环境，随着时间有害影响降低。细胞迁移实验表明 MTA 和 BG 添加不改变 DPSCs 迁移能力；细胞粘附实验中 MTABG4 组粘附能力高，推测是 BG 释放的钙离子影响了 DPSCs 对胶原的粘附。

样本在 SBF 或蒸馏水中浸泡 2 周形成羟基磷灰石，SEM 观察到 DPSCs 能粘附在所有实验组水泥表面，且 BG 添加使 MTA 在牙本质小管中有沉淀，X 射线衍射分析表明沉淀与羟基磷灰石形成增加有关。MTA 与蒸馏水混合后形成氢氧化钙，导致高碱性，SBF 组 pH 较低是因其缓冲能力。

ALP 是早期成骨 / 成牙本质分化生物标志物，SBF 处理的 MTABG 组 ALP 活性最高。ARS 染色显示 SBF 处理组 14 天后矿化增强，BG 添加促进了矿化。RT - qPCR 分析的标记基因结果表明，MTA 和 MTABG 促进了 DPSCs 的成牙本质分化和矿化。

本研究使用的 DPSCs 存在个体差异和细胞衰老等问题。未来需要更多不同供体年龄和组织炎症状态的 DPSCs 体外实验、临床前动物体内实验，以及新 MTABG 盖髓材料的临床研究，以推动牙髓再生治疗发展。研究结果表明，BG 添加到 MTA 中的生物相容性与传统 MTA 相当，在 SBF 处理下，BG 添加的 MTA 矿化潜能更高，尤其在 4wt% BG 浓度时，这为牙髓再生治疗提供了新的材料选择方向。