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T 细胞可通过胞啃作用（trogocytosis）交换膜相关分子，影响免疫反应。本文发现 T 细胞能通过胞啃交换嵌合抗原受体（CAR），使受体 T 细胞获得抗肿瘤免疫，且胞啃受跨膜结构域调控。这一成果为 CAR-T 细胞疗法带来新启示，值得关注。
引言
免疫细胞可通过胞啃作用共享细胞膜相关分子，该过程能正向或负向调节免疫反应。比如，边缘区 B 细胞从树突状细胞获取肽 - 主要组织相容性复合体 II（MHCII）复合物，增强抗原呈递，促进免疫细胞合作；NK 细胞从工程化表达 CCR7 的 K562 细胞获取 CCR7，影响免疫细胞归巢 。在 CAR - T 细胞治疗中，恶性 B 细胞将 CD19 转移至 CD19 导向的 CAR - T 细胞，会导致抗原逃逸和 CAR - T 细胞自相残杀，成为治疗耐药的一种机制。
以往研究表明，T 细胞可在免疫突触与抗原呈递细胞（APCs）通过胞啃交换分子，如 MHCII、CD80 和 OX40 等。蛋白 - 蛋白相互作用，如淋巴细胞功能相关抗原 - 1（LFA - 1）与细胞间粘附分子 - 1（ICAM - 1）的相互作用，或 CD28 与 CD80 或 CD86 的相互作用，可促进 APCs 与 T 细胞间的分子交换，抑制这些分子则会阻断胞啃作用。肌动蛋白细胞骨架和蛋白激酶 Src、磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）也是胞啃作用的关键介质。不过，关于选择哪些分子进行胞啃的分子机制细节仍不清楚，一般认为，若受体细胞在细胞表面展示供体细胞蛋白的同源结合伴侣，则该蛋白可被胞啃。
在本研究中，研究人员发现 T 细胞可通过胞啃作用主动转移 CARs 和 T 细胞受体（TCRs），使受体 T 细胞获得抗肿瘤免疫力。而且，受体 T 细胞表面存在结合伴侣并非蛋白被胞啃的必要条件，蛋白的跨膜（TM）结构域通过影响其在两个 T 细胞界面和 T 细胞微绒毛中的定位，决定了哪些分子可通过胞啃作用转移。
结果
- CAR - T 细胞可将 Thy1.1 转移至其他免疫细胞：为研究 T 细胞间胞啃作用的普遍性，研究人员将激活的 Thy1.1+CD45.2+ T 细胞（Thy1.1 供体）与 Thy1.2+CD45.1+（受体）T 细胞混合培养过夜。流式细胞术分析显示，受体 Thy1.2+CD45.1+ T 细胞表面出现 Thy1.1 染色，且染色强度与供体 / 受体比例成正比。Thy1.1 的转移需要供体和受体 T 细胞接触，在 30 分钟内即可观察到交换，抑制肌动蛋白细胞骨架聚合可显著减少 Thy1.1 分子的交换，Thy1.2 分子也能反向转移，表明 T 细胞胞啃具有双向性。
激活供体或受体 T 细胞足以介导 Thy1.1 转移，两者均激活时转移率最高。转移到受体 T 细胞表面的 Thy1.1 分子持续时间较短，在分离培养 1 天后，阳性细胞比例从 90% 降至 30%，3 天后迅速下降。
通过构建表达 mGreenLantern（mGL） - Thy1.1 融合蛋白的供体 CAR - T 细胞，进行共聚焦实时成像观察发现，在供体 - 受体细胞相互作用 30 - 60 分钟后，mGL - Thy1.1 分子小焦点转移至受体 dsRed+ T 细胞；24 小时后，Thy1.1 分子在受体 T 细胞表面形成大焦点。
在体内实验中，将表达 Thy1.1 的 hIL - 13Rα2 CAR - T 细胞或未转导的 T 细胞注射到 Thy1.2+CD45.2+小鼠尾静脉，1 天后在宿主 T 细胞中检测到 Thy1.1 染色。在原位免疫活性 GL261 胶质母细胞瘤模型中，CAR - T 细胞可将 Thy1.1 转移至宿主的 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞，表明 CAR - T 细胞在体内外均可与其他免疫细胞交换分子。2. CARs 可被胞啃至其他 T 细胞：鉴于 Thy1 分子可从 CAR - T 细胞胞啃转移，研究人员进一步探究 CAR 分子是否也能在 T 细胞间转移。将小鼠 hIL - 13Rα2 CAR - T 细胞或未转导的 T 细胞与 dsRed+受体 T 细胞混合培养，过夜后通过流式细胞术和免疫荧光染色检测发现，CAR 和 TCR 分子出现在受体 T 细胞表面，且呈斑片状分布形成大焦点，供体 T 细胞表面 CAR 或 TCR 水平在有无受体 T 细胞存在时相似，说明胞啃不会显著削弱供体 T 细胞的功能。
激活 T 细胞可增加胞啃作用，用表达抗原的肿瘤细胞刺激 CAR - T 细胞，能增强其向 dsRed 受体 T 细胞捐赠 CAR 分子的能力，同样，用表达抗原的肿瘤细胞刺激 OT - I 表达 T 细胞（TCR - T 细胞），也能增加 TCR 的胞啃转移。
在体内实验中，将 CD45.1+ CAR - T 细胞或未转导的 T 细胞注射到荷瘤小鼠体内，6 天后在脑内的内源性 CD45.2+ T 细胞表面检测到 CAR 分子，证明 CAR 分子可在体内转移至内源性 T 细胞。
对人源 CAR - T 细胞的研究发现，转导人外周血单个核细胞（PBMCs）后，在表达 CAR - T2A - GFP 的样本中检测到 GFP?CAR+ T 细胞（受体 T 细胞），而在仅转导 GFP 的样本中未检测到，表明人源 CAR - T 细胞也能将 CAR 分子转移至其他 T 细胞。3. CAR 和 TCR 受体 T 细胞获得对肿瘤抗原的应答能力：为确定胞啃的免疫受体转移后是否仍保持功能，研究人员建立了由供体 hIL - 13Rα2 CAR - T 细胞、受体 dsRed+ T 细胞和表达 hIL - 13Rα2 的 GL261 肿瘤细胞或野生型 GL261 细胞组成的三重共培养系统。同时，用表达 OT - I 的 T 细胞（TCR - T 细胞）和表达 OVA 的 GL261 细胞或野生型 GL261 细胞进行 TCR 转移研究，并设置 Transwell 实验作为对照。
过夜共培养后，当受体 dsRed+CD8+ T 细胞与 CAR 或 TCR 供体 T 细胞及表达同源抗原的肿瘤细胞共培养时，会上调 T 细胞激活标记物，如颗粒酶 B（GZMB）、干扰素 - γ（IFN - γ）和 CD25，下调初始 T 细胞标记物 CD62L，细胞体积增大且细胞质颗粒增多。dsRed+CD4+受体 T 细胞在相同条件下也会激活，但程度较弱。
激活 CAR 和 TCR 分子可诱导活化 T 细胞核因子（NFAT）去磷酸化和信号传导。构建表达 tdTomato 和由 8x NFAT 结合元件与迷你启动子组成的诱导型启动子的报告载体，当受体 T 细胞与供体 CAR - T 细胞或 TCR - T 细胞及携带相应抗原的肿瘤细胞共培养时，其发光水平高于对照组，表明转移的抗原受体保持功能。
分离受体 CAR - T 细胞后，与肿瘤细胞共培养，发现其具有激活表型并能杀伤肿瘤细胞；而受体 TCR - T 细胞仅部分激活，杀伤能力不显著。用人源 CAR - T 细胞进行实验，也得到类似结果，表明人源 CAR - T 细胞可将功能性 CAR 分子转移至受体 T 细胞，使其对肿瘤抗原产生应答。4. TM 结构域决定 T 细胞间的蛋白质交换：以往观点认为，胞啃作用由蛋白与其受体细胞表面的同源结合伴侣结合介导，但 TCRs 和 CARs 在受体 T 细胞上没有同源结合伴侣。为验证该假说，研究人员构建了融合 Thy1 TM 结构域序列但缺乏 Thy1.1 细胞外结构域的细胞外 mGL 蛋白（mGL - Thy1TM），将其与受体 dsRed T 细胞混合培养，发现 mGL - Thy1TM 与 mGL - Thy1.1 转移效率相当，说明受体细胞表面无需表达同源结合蛋白，胞啃也能发生。
研究人员观察到 CD45 比 Thy1.1 更难转移，推测蛋白质锚定在膜上的方式可能影响其被胞啃的概率。构建具有不同 TM 结构域特性的膜结合 mGL 突变体，包括 Thy1 TM 结构域（mGL - Thy1TM）、CD28 TM 结构域（mGL - CD28TM）和 CD45 TM 结构域（mGL - CD45TM）。将表达这些突变体的 T 细胞与 dsRed 受体 T 细胞混合培养，发现 mGL - CD45TM 分子的交换效率显著低于 mGL - Thy1TM 和 mGL - CD28TM，且 mGL - CD45TM 在 T 细胞微绒毛中的定位减少，主要集中在微绒毛基部。
进一步构建同时表达 mGL - CD45TM 和 mSca - CD28TM 的载体，转导 T 细胞后与受体 T 细胞共培养，结果只有带有 CD28TM 结构域的荧光蛋白被受体细胞获取，且 mSca - CD28TM 在 T 细胞微绒毛中占据的面积更大，证实 TM 结构域在介导蛋白质胞啃中起关键作用。
构建 CD28 TM 结构域被 CD44 或 CD45 TM 结构域取代的 CAR，与受体 dsRed+ T 细胞共培养，发现 CD44 或 CD45 TM 结构域锚定的 CAR 分子胞啃转移显著减少，且 CAR - CD45TM 在微绒毛中的定位减少，在细胞间接触区域被排除。对 CAR - CD45TM 的近膜区域进行 K23L 突变，可增加 CAR 胞啃转移，表明增加 TM 结构域的灵活性可促进 CAR 分子的胞啃。在人源 CAR - T 细胞中，也观察到 CD45TM CAR 分子的胞啃转移明显低于传统 CD8 TM CARs。
讨论
本研究表明，T 细胞间的蛋白质胞啃作用受 TM 结构域调节，抗原受体的水平转移可扩展 T 细胞的功能，且不依赖于其基因表达谱。
此前研究发现，CD19 导向的 CAR - T 细胞可通过胞啃被动获取恶性 B 细胞的靶 CD19 分子，导致抗原逃逸、T 细胞耗竭和自相残杀，但 CAR - T 细胞向其他免疫细胞转移膜蛋白（包括 CAR）的能力一直被忽视。本研究不仅证实了人源和鼠源激活 T 细胞在体外可通过胞啃交换 CARs 和 TCRs，还发现鼠源 CAR - T 细胞在体内也能将分子转移至 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞，不过 CAR - T 细胞在体内共享分子的具体环境还有待进一步阐明。
T 细胞激活在促进 T 细胞提供和接收分子方面起重要作用，被肿瘤细胞刺激后的 CAR - T 细胞和 TCR - T 细胞向其他 T 细胞捐赠分子的能力增强。转移的抗原受体保持功能，使受体细胞能对表达相应抗原的靶细胞作出反应。虽然胞啃的 CARs 和 TCRs 在 T 细胞表面持续时间较短，但在更接近肿瘤微环境的三重共培养体系中，受体 T 细胞对肿瘤抗原的反应更显著，新获得的受体激活 T 细胞可改变其表型。
研究还确定了影响 T 细胞间膜蛋白胞啃选择的关键因素，即 TM 结构域。蛋白在微绒毛中的定位与其被胞啃的概率相关，具有合适 TM 结构域的蛋白，即使在受体 T 细胞表面没有同源结合伴侣，也能有效转移。
在 CAR - T 细胞治疗中，肿瘤细胞捕获 CAR 分子会降低 CAR - T 细胞功能。通过修饰 CAR 分子的 TM 结构域阻止其胞啃，或选择不易与 CAR - T 细胞发生胞啃的靶点，可避免肿瘤细胞向 CAR - T 细胞的胞啃，减少自相残杀和脱靶毒性。
本研究虽阐明了分子被选择进行胞啃的机制，但在癌症背景下，CAR 武装的受体细胞的影响还需在更复杂的临床前小鼠模型中进一步研究。此外，人源 T 细胞间 CAR 胞啃现象在临床环境中的后果也有待明确。总体而言，T 细胞上抗原受体的胞啃作用可将抗肿瘤免疫力转移至受体 T 细胞，促进其激活和抗肿瘤反应，同时不削弱供体 T 细胞的受体功能。通过调节 CAR 的 TM 结构域可调控 CAR 胞啃，为新型 CAR 设计提供了思路，可根据具体情况促进或抑制胞啃作用。
材料和方法
- 研究设计：本研究主要目的是探究 T 细胞胞啃作用的机制，以及评估获得 CAR 和 TCR 分子的 T 细胞对肿瘤抗原的反应。通过不同小鼠品系来源的 T 细胞共培养，区分供体和受体细胞，研究胞啃机制；利用原位 GL261 胶质瘤模型，因其免疫细胞浸润水平高，适合研究 T 细胞在体内的分子交换，实验终点设定为肿瘤植入后 21 天。在体外，通过三重共培养系统模拟 CAR 和 TCR 受体细胞的反应，利用不同小鼠品系或 GFP 标记区分供体和受体细胞。体外实验至少重复 3 次，动物模型实验根据模型预期变异性重复 1 - 3 次，剔除实验终点无可见肿瘤的小鼠，具体重复次数和 P 值在图注和图中明确显示。
- 动物品系：实验使用多种小鼠品系，包括 C57BL/6N CD45.2、CD45.1、C57BL/6 Thy1.1、C57BL/6 OT - I+、C57BL/6 CD2 - dsRed+等，均从相应机构购买或获赠，并在内部繁殖。动物实验遵循 Uppsala University 的动物实验和福利指南，经 Uppsala County regional research animal ethics committee 批准。
- 原位鼠胶质瘤模型：选用 6 - 8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠，麻醉后在立体定位仪上进行 GL261 胶质瘤细胞颅内注射。术后密切观察小鼠状态，根据 Uppsala University 的动物福利评分系统监测肿瘤相关症状，实验终点为第 21 天或福利评分达到上限时，对小鼠实施安乐死并采集大脑进行流式细胞术分析。
- 载体和克隆：研究中使用的所有载体序列可在相关表格中获取。多种载体通过构建、克隆、购买等方式获得，包括 p - MIG - W CAR - T2A - mGL - Thy1.1、pRetroX - 8xNFAT - miniP - NanoLuc - mPGK - tdTomato 等，构建过程涉及氨基酸序列获取、载体设计、克隆、突变等操作，所有构建体均经 Sanger 测序验证，相关引物信息在表格中列出。
- 细胞培养：多种细胞系，如人胚肾（HEK）293 细胞、多种胶质瘤细胞系等，在相应培养基中培养。原代小鼠 T 细胞和人外周血单个核细胞（PBMCs）来源的 T 细胞，在含有多种添加剂的培养基中培养，并添加细胞因子促进其激活和存活。通过添加 latrunculin B 抑制肌动蛋白细胞骨架。
- 鼠 T 细胞分离和激活：从小鼠脾脏提取 T 细胞，经红细胞裂解、磁珠分选后，用抗 CD3/CD28 抗体偶联磁珠和 hIL - 2 激活 24 小时。
- 逆转录病毒生产：通过共转染 HEK293 细胞，使用特定转染试剂在无血清 OPTI - MEM 中进行。转染后收集上清，离心浓缩病毒，储存于 - 80°C 备用。
- 慢病毒生产：与逆转录病毒生产类似，共转染 HEK293 细胞，使用特定转染试剂，后续处理与逆转录病毒生产相同。
- 鼠 CAR - T 细胞制备：用 Retronectin 包被培养板，激活 T 细胞 24 小时后，与浓缩病毒和 hIL - 2 混合，离心后培养，实现 T 细胞的高效转导。
- 慢病毒转导 T 细胞和 GL261 细胞：PBMCs 来源的 T 细胞激活后，与浓缩慢病毒、polybrene 和细胞因子混合培养过夜；GL261 肿瘤细胞在特定条件下用慢病毒转导，经嘌呤霉素筛选后用于实验。
- 杀伤实验：将肿瘤细胞与分选后的 CAR/TCR 受体 dsRed+ T 细胞或 CAR - T 细胞表达 CAR - TM 突变体，按一定比例在 96 孔板中培养，通过检测荧光素酶活性评估肿瘤细胞活力，判断杀伤效果。
- NFAT 活性检测：用含有受诱导型迷你启动子和 8x NFAT 结合元件控制的 NanoLuciferase（NanoLuc）的逆转录病毒载体转导 T 细胞，使用相应检测系统评估 NFAT 激活情况。
- 共聚焦成像：使用 Leica TCS SP8 AOBS 共聚焦激光扫描显微镜进行成像，包括固定细胞染色成像和活细胞成像。固定细胞染色后用 4% 多聚甲醛固定，活细胞转导后与未转导
