具有高特异性和亲和力的标记唾液聚糖的突变糖苷酶

　　

用于高特异性和高亲和力标记唾液酸聚糖的突变糖苷酶

摘要：生物大分子的亲和标记对于生物成像和功能研究至关重要。然而，能够高特异性识别聚糖的亲和探针仍然稀缺。本文中，来自北京大学化学与分子工程学院等机构的研究人员报道了基于突变细菌唾液酸酶开发的聚糖重组亲和结合剂（GRABs），这些结合剂虽无酶活性，但对唾液酸聚糖底物保留了严格的特异性。通过对肺炎链球菌神经氨酸酶 A（SpNanA）和迟缓埃格特菌神经氨酸酶 H（RgNanH）的关键催化残基进行突变，研究人员开发出了分别识别总唾液酸聚糖和 α2,3 - 唾液酸苷的 GRAB - Sia 和 GRAB - Sia3。GRABs 展现出严格的底物和连接特异性，并且与链霉亲和素四聚化后可显著提高其亲和力。GRABs 和四聚体 GRABs（tetra - GRABs）是在免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀和荧光成像中探测唾液酸聚糖的有效工具。此外，利用 tetra - GRABs 进行的多重分析揭示了小鼠不同器官中空间上不同的唾液酸聚糖。这项工作为高特异性、高灵敏度和便捷地标记与分析唾液酸聚糖提供了一套通用的工具。

所有细胞都被一层结构复杂且动态调节的聚糖紧密覆盖，主要表现为糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖。作为分子识别的配体，细胞表面聚糖对于多种生理病理过程至关重要。为了解析聚糖的生物学功能，在复杂生物系统中精确标记和分析聚糖是先决条件。亲和标记一直是可视化和分析生物分子的核心工具。对于大多数蛋白质而言，特异性抗体在市场上可购得或易于制备。然而，具有高特异性和高亲和力的聚糖特异性抗体却极难获得。这在一定程度上是由于聚糖序列和结构在脊椎动物中的保守性，使得聚糖成为低免疫原性的抗原。此外，现有的聚糖抗体通常是使用糖肽抗原制备的，因此除了聚糖表位外，它们通常还会结合特定的多肽序列，导致对携带相同聚糖的不同糖肽存在偏差。另外，聚糖通常极少激活 T 细胞依赖的抗体反应，产生亲和力和特异性较低的免疫球蛋白 M 同种型。作为替代方案，凝集素（一类庞大的聚糖结合蛋白家族）已被用作聚糖标记和分析的亲和探针。凝集素通常源自植物，并非由免疫系统产生，且其亲和力和特异性有限。

自然界巧妙地进化出了糖酶，包括糖基转移酶和糖苷酶，它们分别以严格的特异性合成和水解聚糖。在过去几十年中，糖酶已成功被改造为聚糖标记工具。例如，通过利用糖基转移酶变体接受带有生物正交功能基团修饰的非天然糖核苷酸，开发出了化学酶促聚糖标记策略。在将非天然糖转移到特定聚糖上之后，进行生物正交反应以连接功能探针。

相比之下，糖苷酶仅与聚糖相互作用，如果在保留结合特异性的同时使其酶活性发生突变，那么糖苷酶有可能被开发为聚糖结合剂。对此，开创性的研究已证明，对细菌 O - GlcNAcase 和细菌 O - 糖蛋白酶的特定氨基酸残基进行突变，可产生分别对 O - GlcNAc 和粘蛋白结构域糖蛋白具有底物结合能力但无酶活性的变体。

以 N - 乙酰神经氨酸（Neu5Ac）为最常见形式的唾液酸，是一类九碳单糖，在哺乳动物中终止各种细胞表面聚糖。唾液酸可以 α2,3 - 或 α2,6 - 连接到半乳糖（Gal）上，α2,6 - 连接到 N - 乙酰半乳糖胺（GalNAc）上，或者 α2,8 - 连接到另一个唾液酸上。由此产生的唾液酸聚糖连接到 N - 连接和 O - 连接的糖蛋白以及糖脂上。细胞表面唾液酸聚糖在调节分子识别、细胞间通讯和病原体 - 宿主相互作用中发挥着重要作用。特别是，免疫细胞的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）对癌细胞表面唾液酸聚糖的识别有助于调节免疫细胞功能，由于其在癌症免疫治疗中的潜在意义，这一点最近引起了极大关注。重要的是，Siglecs 对唾液酸苷连接表现出独特的特异性。例如，Siglec - 2（CD22）对 α2,6 - 唾液酸聚糖具有严格的特异性。Siglec - 7 主要结合 α2,8 - 唾液酸苷，而 Siglec - 8 则偏好 Neu5Acα2 - 3 [6SO4] Galβ1 - 4GlcNAc。为了标记和分析癌细胞上的唾液酸聚糖，两种分别优先结合 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸聚糖的凝集素 —— 紫穗槐凝集素（MAL - II）和接骨木凝集素（SNA）已被广泛应用。然而，SNA 也会结合 α2,3 - 唾液酸聚糖，尽管亲和力较低。聚糖阵列分析表明，MAL - II 与含有 3 - O - 硫酸化半乳糖的聚糖存在非特异性结合。此外，由于特异性验证通常依赖于聚糖阵列，因此人们对凝集素与其他细胞生物分子（如蛋白质）之间的潜在相互作用存在担忧。另一方面，现有的识别特定唾液酸化糖基序的抗体大多局限于针对多唾液酸（PSA）、唾液酸化路易斯 X 抗原（sLeX）和唾液酸化 Tn 抗原（STn）的抗体。虽然市场上有几种泛特异性唾液酸聚糖抗体（例如，Creative Diagnotics 公司的 CABT - Z313R 和 LSBio 公司的 LS - C664155），但其亲和力和特异性尚未得到充分评估。有趣的是，市场上可买到的源自唾液酸酶的唾液酸聚糖结合剂（即 SiaFindTM Lectenz）似乎是通过计算设计和基于酵母展示的进化产生的。然而，这些试剂的详细设计、作用机制和表征既未完全公开，也未经过同行评审发表。

在此，研究人员报告了基于突变糖苷酶的聚糖重组亲和结合剂（GRABs）的开发及其全面表征，该结合剂具有对唾液酸聚糖的高特异性和高亲和力、使用简便以及生产便捷等特点。研究人员对泛特异性唾液酸酶肺炎链球菌神经氨酸酶 A（SpNanA）和 α2,3 - 唾液酸酶迟缓埃格特菌神经氨酸酶 H（RgNanH）的关键催化残基进行突变，使其在保持对总唾液酸聚糖和 α2,3 - 唾液酸苷高特异性识别的同时失去酶活性。由此产生的 GRAB - Sia 和 GRAB - Sia3 进一步与链霉亲和素四聚化以提高亲和力。GRABs 和 tetra - GRABs 适用于多种实验设置，如免疫印迹、流式细胞术、免疫沉淀和荧光显微镜检查。利用 tetra - GRABs，研究人员在小鼠的心脏、肾脏、肺和肠道等多个器官中可视化了总唾液酸聚糖和 α2,3 - 连接唾液酸聚糖的空间分布。因此，基于突变糖苷酶的 GRABs 代表了一套用于聚糖亲和标记的通用工具，有望在研究聚糖的功能作用方面得到广泛应用。

结果

泛特异性唾液酸聚糖结合 GRAB

为了开发一种不依赖于糖苷键连接方式、能识别唾液酸的泛特异性 GRAB，研究人员利用了 SpNanA。SpNanA 是一种泛唾液酸酶，可水解各种唾液酸聚糖中具有 α2,3、α2,6 和 α2,8 连接的所有末端唾液酸。SpNanA 包含一个 40 型碳水化合物结合模块（CBM40）、一个属于糖苷水解酶家族 33（GH33）的催化结构域和一个 C 末端结构域（C 结构域）。GH33 家族中有三个关键的催化残基保守存在，通常包括一个作为催化亲核试剂的酪氨酸、一个作为碱催化剂使酪氨酸羟基去质子化的谷氨酸以及一个作为酸催化剂使糖苷氧质子化的天冬氨酸（图 1a）。在中间体形成后，保守的天冬氨酸作为碱催化剂，激活进入的水分子（用于水解）或糖基受体（在转唾液酸酶的情况下）。相应地，结构分析已确定 SpNanA 的 D372、E647 和 Y752 为催化酸 / 碱和亲核试剂的三个关键残基（图 1b）。为了从 SpNanA 制备 GRAB - Sia，研究人员重组表达了催化结构域（残基 318 - 792），并将 D372 或 E647 进行突变，同时在 N 末端融合一个六组氨酸（His 标签），分别将其命名为 SpNanA^D372N^、SpNanA^D372A^、SpNanA^E647A^ 和 SpNanA^E647Q^（图 1c 和补充图 1a）。研究人员截短了 CBM40 结构域和 C 结构域，以避免与其他聚糖发生潜在的非特异性结合，因为 CBMs 的底物特异性可能与其融合的催化结构域不同。野生型（WT）SpNanA 催化结构域（以下简称 SpNanA）能够从模型唾液酸糖蛋白胎球蛋白中水解唾液酸，通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）分析可知，这导致胎球蛋白的分子量降低（图 1d）。相比之下，所有突变体均未改变胎球蛋白的分子量，表明其唾液酸酶活性已丧失。使用基于荧光唾液酸苷底物的互补唾液酸酶活性测定也观察到了类似结果（补充图 1b）。然后，研究人员通过流式细胞术测定 SpNanA 突变体与细胞表面唾液酸聚糖的结合能力，从而评估其唾液酸结合能力（补充图 2）。将 HeLa 细胞与带有 His 标签的 SpNanA 突变体孵育，并用别藻蓝蛋白（APC）偶联的抗 His 标签抗体进行染色。研究人员观察到 SpNanA^D372N^ 和 SpNanA^D372A^ 与 HeLa 细胞有很强的结合，而两个 E647 突变体则完全失去了结合能力（图 1e）。值得注意的是，由于 SpNanA 的唾液酸酶活性，它不会产生荧光标记。用 SpNanA 处理野生型 HeLa 细胞以去除细胞表面唾液酸后，显著降低了其与 SpNanA^D372N^ 的结合（图 1f）。此外，研究人员利用 CRISPR/Cas9 系统在 HeLa 和 HEK293T 细胞中敲除了编码胞苷 5'- 单磷酸 - 唾液酸（CMP - Sia）唯一合成酶的 N - 乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶（CMAS）（补充图 3a）。高效阴离子交换色谱（HPAEC）分析表明，CMAS 敲除细胞失去了生物合成 CMP - Sia（唾液酸基转移酶的核苷酸糖供体）的能力（补充图 3b），因此细胞表面聚糖上没有末端唾液酸。SpNanA^D372N^ 与 CMAS 敲除 HeLa 细胞的结合完全消失，证实了其对唾液酸聚糖的严格结合特异性（图 1f）。

为了阐明 SpNanA^D372N^ 结合的唾液酸聚糖亚型，研究人员以胎球蛋白为模型唾液酸糖蛋白，并首先验证其携带多种类型的唾液酸聚糖。使用 SNA 进行的凝集素印迹显示，用泛特异性唾液酸酶 SpNanA 和尿素节杆菌神经氨酸酶（AuNan）处理胎球蛋白，但不用 α2,3 - 唾液酸酶（如 RgNanH 和肺炎链球菌神经氨酸酶 C（SpNanC））处理，会显著消除 SNA 染色，这表明胎球蛋白上存在 α2,6 - 唾液酸聚糖（补充图 4a）。用 α2,3 - 唾液酸酶处理胎球蛋白后，识别去唾液酸化后暴露的 Gal 的蓖麻凝集素 I（RCA I）染色显著增强，这表明胎球蛋白上存在 α2,3 - 唾液酸聚糖（补充图 4b）。研究人员利用 BirA - AviTag 系统在 SpNanA^D372N^ 的 N 末端位点特异性引入生物素，获得了具有高批次间重复性的均一生物素化蛋白质（补充图 5）。通过印迹分析所得的单生物素化 SpNanA^D372N^ 与胎球蛋白的结合情况。用泛唾液酸酶处理胎球蛋白完全消除了这种结合，而 α2,3 - 唾液酸酶处理则导致结合部分减少（补充图 6）。这些结果表明，SpNanA^D372N^ 可与唾液酸糖蛋白结合，推测也可与包括 α2,3 - 和 α2,6 - 唾液酸苷在内的具有不同糖苷键连接的唾液酸聚糖结合。

除了细胞表面染色和印迹分析，研究人员还评估了 SpNanA^D372N^ 是否可用于亲和捕获实验。胎球蛋白被有效捕获，而非糖基化蛋白牛血清白蛋白（BSA）则未被 SpNanA^D372N^ 富集（补充图 7a）。此外，HEK293T 细胞裂解物中的多种蛋白质可被 SpNanA^D372N^ 捕获，但 CMAS 敲除的 HEK293T 细胞或用 SpNanA 预处理的 HEK293T 细胞裂解物中的蛋白质则不能（补充图 7b）。这些结果表明，SpNanA^D372N^ 可作为用于泛特异性唾液酸聚糖标记的 GRAB（以下简称 GRAB - SiaTotal 或 GRAB - Sia）。

α2,3 - 唾液酸苷结合 GRAB

为了开发一种特异性识别 α2,3 - 唾液酸苷的 GRAB，研究人员对同样属于 GH33 家族的 α2,3 - 唾液酸酶 RgNanH 进行了改造，该酶具有保守的催化残基，包括作为酸 / 碱催化剂的 D282 和 E559 以及作为亲核试剂的 Y677（图 2a）。研究人员重组表达并纯化了 RgNanH 的催化结构域（残基 243 - 723）以及 D282A 和 D282N 突变体，并在 N 末端添加了 His 标签（图 2b 和补充图 8a）。正如预期的那样，D282 的突变消除了 RgNanH 的唾液酸酶活性（图 2c 和补充图 8b）。RgNanH^D282N^ 和 RgNanH^D282A^ 均与 HeLa 细胞结合，其中 RgNanH^D282A^ 表现出更高的结合亲和力（图 2d）。由于具有 α2,3 - 唾液酸酶活性，RgNanH 不能稳定地结合到细胞表面。在 CMAS 敲除的 HeLa 细胞中，未观察到 RgNanH^D282A^ 的结合，这证明了 RgNanH^D282A^ 结合对唾液酸的依赖性（图 2e）。重要的是，用 α2,3 - 唾液酸酶选择性切割 α2,3 - 连接的唾液酸以及用泛特异性唾液酸酶去除所有唾液酸后，单生物素化的 RgNanH^D282A^ 与胎球蛋白的结合被充分消除（图 2f 和补充图 8c）。这些结果表明，RgNanH^D282A^（以下简称 GRAB - Sia3）可与携带 α2,3 - 唾液酸苷的唾液酸糖蛋白结合，可能是通过识别 α2,3 - 唾液酸聚糖实现的。在后续章节中，研究人员对这两种 GRAB 的聚糖底物特异性进行了更详细的表征。

接下来，研究人员将 GRABs 的结合特异性与两种广泛用于识别唾液酸聚糖的凝集素 SNA 和 MAL - II 进行了对比。此外，研究人员还同时比较了 SiaFindTM Lectenz 试剂盒。为了确保与生物素化的 GRABs 具有可比性，研究人员使用了市售的生物素化 SNA、MAL - II 和 SiaFindTM Lectenz。将野生型和 CMAS 敲除的 HEK293T 细胞与生物素化的凝集素、SiaFindTM Lectenz 或 GRAB 孵育，然后用链霉亲和素 - AF647 染色并进行流式细胞术分析。所有凝集素、SiaFindTM Lectenz 和 GRABs 在很宽的浓度范围内都能有效地与野生型 HEK293T 细胞结合（补充图 9）。在 CMAS 敲除的 HEK293T 细胞中，GRABs 在浓度高达 100 μg/mL 时表现出可忽略不计的非特异性结合。相比之下，在浓度低至 0.2 μg/mL 时，研究人员就观察到 SNA 和 MAL - II 与 CMAS 敲除的 HEK293T 细胞有明显结合，这与之前观察到的 SNA 和 MAL - II 的非特异性结合现象一致。同样，在 5 μg/mL 的泛特异性 SiaFindTM Lectenz（版本 1.0 和 2.0）和 25 μg/mL 的 α2,3 特异性 SiaFindTM Lectenz 处理下，CMAS 敲除的 HEK293T 细胞也出现了明显结合（图 2g 和补充图 9）。在野生型 HEK293T 细胞中产生相似荧光强度的浓度下，GRABs 在所有唾液酸结合剂中表现出最高的特异性（标记的野生型细胞和标记的 CMAS 敲除细胞之间的 MFI 倍数变化）和最低的非特异性结合（标记的和未标记的 CMAS 敲除细胞之间的 MFI 倍数变化）（图 2g）。这些结果证明了 GRABs 对唾液酸聚糖具有卓越的特异性。

GRABs 的四聚化和底物特异性

接下来，研究人员通过等温滴定量热法（ITC）分析对 GRABs 的结合亲和力进行了定量测定。GRAB - Sia 对 α2,3 - 唾液酸乳糖（3’SL）和 α2,6 - 唾液酸乳糖（6’SL）表现出相当的亲和力，解离常数（