组织剪切力作为果蝇发育中翅膀平面极性排列的线索
摘要
上皮组织中平面极性的建立需要在细胞和分子水平上解读组织层面的方向信息。组织形态发生过程中产生的机械力正逐渐成为关键的组织层面方向线索，然而，其调节平面极性的机制却知之甚少。通过对果蝇蛹翅的研究，“第一作者单位” 的研究人员证实组织应力促进近端 - 远端（PD）平面极性排列。此外，高组织应力各向异性会降低核心平面极性蛋白卷曲蛋白（Frizzled，Fz）在细胞连接处的积累速率，并降低其稳定性。值得注意的是，在高组织应力各向异性条件下，研究人员观察到细胞流梯度增加，表现为相邻细胞排之间的速度差异。这促进了细胞 - 细胞接触处核心蛋白的周转，且平行于流动方向，可能是通过剪切力使跨膜复合物解离实现的。研究人员提出，细胞流梯度在果蝇蛹翅发育过程中对建立和维持 PD 方向的极性排列起着关键作用。
一、引言
模式形成涉及多个尺度的对称性破缺，涵盖分子、细胞和组织层面。上皮组织是一个简单的例子，它具有显著的能力，能使表面结构（如毛发、纤毛和静纤毛）集体定向和排列。这一特征在不同组织和物种中广泛存在，由平面极性（或平面细胞极性）通路调控，该通路调节上皮平面内极性的建立。这一过程对组织的组织和模式形成至关重要，其破坏会导致脊椎动物（包括人类）出现一系列发育缺陷。核心平面极性通路（以下简称核心通路）是平面极性组织所需的关键分子通路，在动物界中高度保守。
在果蝇翅膀中，平面极化背后的机制已得到广泛研究。核心通路使翅膀毛发始终向远端定向（如图 1a 中蛹形成后 32 小时（hAPF）的翅膀所示）。核心通路活动在连接相邻细胞的黏着连接处产生不对称的蛋白质分布。在果蝇翅膀中，这些复合物位于细胞的近端和远端界面（图 1a’）。核心机制由六种核心极性蛋白组成，其中包括七次跨膜钙粘蛋白 Flamingo（Fmi；在无脊椎动物中也称为 Starry Night [Stan] 或 Celsr），负责桥接相邻细胞的同嗜性相互作用。Fmi 在细胞接触的相对两侧与不同的伙伴结合。在一个细胞中，Fmi 与七次跨膜蛋白 Frizzled（Fz；在脊椎动物中为 Fzd）以及两种胞质相关蛋白 Dishevelled 和 Diego 形成复合物（图 1a”）。在相邻细胞中，Fmi 招募跨膜蛋白 Strabismus（Stbm；也称为 Van Gogh [Vang] 或 Vangl）以及胞质相关蛋白 Prickle。核心通路功能丧失会导致翅膀毛状体最初在细胞中心起始，随后在翅膀表面呈现漩涡状排列。
核心蛋白参与放大不对称性，并协调相邻细胞之间的极化，以产生局部对齐的极性。破坏平面极性局部组织的 fz 或 stbm 突变体的镶嵌克隆，会导致克隆附近的翅膀毛状体定向错误。这意味着细胞极性在相邻细胞之间存在内在联系，有助于在独立于组织层面线索的情况下实现局部极性协调。然而，实验研究和理论模型表明，克隆边界处的极性破坏只能在几个相邻细胞中传播。这表明细胞间信号传导不足以确保整个组织中极性的一致排列，还必须有额外的组织层面线索来协调器官轴方向的平面极性。确定这种全局极性协调的总体线索的确切来源，一直是一个长期的研究问题。
在发育过程中，已知参与组织模式形成的形态发生线索，如分级的 Wnt 配体和 Fat - Dachsous 通路基因表达梯度，是全局平面极性定向线索的有力候选者。然而，Wnt 梯度作为组织层面线索在调节果蝇发育中翅膀平面极性的作用仍存在争议：虽然先前的研究表明 Wnt 表达可以调节全局极性定向，但两项独立研究报告称，去除内源性 Wnts 不会导致平面极性缺陷。Fat - Dachsous 通路的成分 Dachsous 和 Four - jointed 在发育中的翅膀上呈相反的梯度表达，敲除 fat 或 dachsous 的活性会导致严重的平面极性缺陷。然而，均匀的 Dachsous 表达足以有效地建立正确定向的平面极性。此外，在 dachsous 突变体翅膀中，细胞形态发生事件（如细胞伸长和定向细胞分裂）受到严重干扰，这表明它通过调节组织上皮动力学来影响平面极性。
组织形态发生过程中产生的各向异性组织应力，已成为一种引人注目的组织层面线索，能够协调细胞行为，并在多个细胞距离上影响平面极性定向。在果蝇蛹翅发育过程中，从约 16 hAPF 开始，翅膀铰链的收缩会沿近端 - 远端（PD）轴产生各向异性组织应力，导致翅膀叶片伸长（图 1a）。这种张力持续增加，直至 24 hAPF 达到峰值，然后在 27 hAPF 逐渐减弱。与此同时，核心平面极性的轴发生重新定向，从主要的前后（AP）方向转变为 PD 方向（图 1a）。此外，改变各向异性组织应力足以扰乱果蝇、小鼠和爪蟾的组织动力学和平面极性排列，这表明它们之间存在因果关系。
各向异性组织应力影响极性定向的一种潜在机制，涉及极化细胞重排，也称为 T1 转变。这一过程与果蝇翅膀中的极性重新定向以及小鼠发育中表皮的极性建立相吻合。在定向 T1 转变事件中，垂直于组织应力轴的连接收缩，同时新的连接形成并平行于组织应力轴伸长，以此作为缓解组织应力的一种机制。从机制上讲，有人提出核心蛋白复合物优先保留在现有连接上，而在 T1 转变产生的新连接上积累缓慢，这随后有助于沿组织应力轴进行极化。事实上，通过切断翅膀铰链改变 T1 转变的方向，会导致极性排列紊乱。然而，T1 转变后核心蛋白复合物在新形成的连接上积累缓慢的原因尚不清楚。
此外，各向异性组织应力可能通过影响微管的方向来定向极性。多项研究报道了极化微管在蛹翅中核心极性蛋白向远端细胞连接的定向运输中的作用。与 PD 平面极性重新定向同时发生的翅膀叶片伸长，导致细胞沿 PD 方向伸长，并形成 PD 方向的微管排列。这些极化的微管可能有助于将新蛋白质输送到远端（垂直）连接。然而，目前尚无报道表明，如何从平行于 PD 轴的水平连接上去除预先存在的核心蛋白，从而导致极性重新定向。一种可能的解释是，水平连接上的核心蛋白会随着时间降解。然而，在核心蛋白极化达到峰值前的几个小时，细胞伸长和微管极化都会逐渐减弱。这表明存在其他机制来维持已建立的极性，例如，通过持续阻止核心蛋白在水平连接上的积累。这可能涉及自组织细胞机制，即垂直连接上较高的蛋白质积累会抑制水平连接上的积累。或者，其他依赖于组织应力的机制也可能在这一过程中发挥作用。
在本研究中，“第一作者单位” 的研究人员利用果蝇蛹翅来阐明机械组织应力对全局核心平面极性排列影响的分子机制。研究人员提供的证据表明，各向异性组织应力的降低会导致沿 PD 轴的极性排列紊乱，同时增加核心蛋白复合物关键成分 Fz 的稳定性。此外，研究人员观察到，T1 转变后 Fz 在新生连接上的积累速率，取决于组织应力各向异性的水平：在组织应力降低的条件下，Fz 在新连接上的积累更快，而在应力较高时则更慢。对组织动力学的详细研究揭示了细胞流梯度的存在，其特征是相邻细胞排之间的速度差异，这种差异在蛹翅发育过程中随着组织应力各向异性的增加而出现。当各向异性应力降低时，这种细胞流梯度减小，导致 Fz 稳定性增强。相反，急剧增加细胞流梯度会降低与流动轴对齐的连接上 Fz 的稳定性。在正常发育过程中，较高的细胞流梯度（表明相邻细胞排之间的相对运动加剧）似乎有助于破坏与细胞运动方向（沿 PD 轴）对齐的连接处的核心蛋白复合物，从而在沿 PD 轴强化 Fz 极性方面发挥作用。研究人员推测，这一过程是由细胞间连接处的剪切应力驱动的，这种剪切应力由细胞的相对运动引起，导致跨膜复合物的解离和重塑。研究人员提出，细胞流梯度在整个组织中建立和维持平面极性排列方面起着关键作用。
二、结果
2.1 翅膀形态发生过程中的组织应力和 Fz 动力学
最初，“第一作者单位” 的研究人员研究了在蛹翅发育的 24 - 32 hAPF 期间（翅膀毛发（毛状体）形成之前），组织应力、核心平面极性蛋白稳定性和极性的动态变化。在这个阶段，细胞经历重排，有助于确定最终的翅膀形状，且不受细胞分裂和凋亡的干扰。
已知果蝇翅膀上皮中肌球蛋白 II（果蝇中为 Sqh）的极化细胞分布（各向异性）与组织应力相关。此外，Kale 等人证明了连接肌球蛋白 II 密度与连接张力（通过激光消融后的回缩速度测量）之间存在显著相关性，并且由于组织拉伸，肌球蛋白 II 在受张力的连接上富集，从而导致肌球蛋白 II 极化增加。这表明肌球蛋白 II 可作为连接张力分布的读数。同样，研究人员使用 Fz 稳定性作为核心平面极性复合物稳定性的读数。
研究人员对表达 Fz::EGFP 和 Sqh::3xmKate 的野生型翅膀的近端 - 后部区域（图 1a 中纵脉 5 下方的绿色框）进行了时间序列成像。在 24 至 28 hAPF 期间，肌球蛋白 II 在细胞连接处表现出显著的极化富集，水平连接（平行于 PD 轴定向）上的肌球蛋白 II 水平高于垂直连接（平行于 AP 轴定向）（图 1b）。这表明水平连接比垂直连接承受更大的张力，正如先前报道的那样。为了检查相关的各向异性组织应力，研究人员分析了粗粒度的肌球蛋白 II 极性。从 24 到 28 hAPF，肌球蛋白 II 极性主要与 AP 轴对齐，这表明沿 PD 轴的组织应力更强（图 1b 中的黄线）。为了跟踪组织应力各向异性随时间的演变，研究人员量化了平均肌球蛋白 II 极性大小。从 24 hAPF 开始，该值下降，表明组织应力各向异性减弱，这可归因于从 20 hAPF 开始翅膀铰链收缩逐渐减少。相反，从 24 到 32 hAPF，对粗粒度 Fz::EGFP 极性的分析表明，细胞群体中 Fz 沿 PD 轴的对齐越来越协调（图 1b 中的黄线）。此外，随着时间的推移，Fz::EGFP 在垂直连接上的不对称富集增加，平均 Fz::EGFP 极性大小的增加证明了这一点，这与先前的研究一致。
组织应力各向异性与 Fz 极性协调之间相关性的一种可能解释是，组织应力各向异性直接调节细胞连接处 Fz 的极性和稳定性。
过去，组织应力各向异性是通过激光消融技术评估的，该技术依赖于对初始回缩速度的测量。为了进一步评估蛹翅形态发生后期组织应力各向异性的时间进程，研究人员对蛹翅的近端 - 后部区域进行了圆形激光消融。应力各向异性的大小通过测量消融圆在长轴和短轴上的初始回缩速度之差来确定（图 1c 和补充图 1a）。实验结果显示，从 24 到 32 hAPF，组织应力各向异性逐渐减弱（图 1c，c’），这与先前的发现以及研究人员的肌球蛋白 II 极性数据一致（图 1b’）。
除了 Fz 极性，在组织应力各向异性降低的同一发育时期，Fz 稳定性逐渐增加，这意味着 Fz 去稳定化与组织应力之间可能存在联系。因此，研究人员使用 Fz 串联荧光定时器融合蛋白，评估了不同时间点定位在细胞连接处的 Fz 蛋白的稳定比例（补充图 1b，b’和 “方法”）。与先前使用光漂白后荧光恢复（FRAP）分析获得的结果一致，研究人员的观察结果也显示，从 24 到 32 hAPF，相对稳定的 Fz 增加（图 1c’和补充图 1f，g）。因此，在本研究中，研究人员采用荧光定时器来定量评估细胞连接处稳定 Fz 的相对浓度。
综合这些结果，研究人员发现，在 24 至 32 hAPF 期间，近端翅膀中组织应力各向异性的演变与 Fz 极性和稳定性之间存在显著的负相关（图 1b’，c’）。为了加强这一发现，研究人员还观察了远端翅膀区域。先前的研究表明，蛹翅不同区域的组织应力各向异性存在差异。事实上，研究人员发现，在 24 和 28 hAPF 时，近端区域的肌球蛋白 II 极性显著高于远端区域（图 1d，e）。此外，在 24 hAPF 时，近端区域的细胞比远端区域的细胞更细长（图 1f）。到 32 hAPF 时，不同区域之间的肌球蛋白 II 极性和细胞偏心率没有显著差异（图 1e，f）。比较蛹翅不同区域的局部 Fz 极性协调，在 32 hAPF 时，近端翅膀区域沿 PD 轴的局部极性协调也显著高于远端区域（较高的极性角方差表示图像内所有细胞的极性角方差较高）（图 1g 和补充图 1c）。相反，这些翅膀区域之间的平均 Fz 极性大小没有显著差异（补充图 1d，e）。值得注意的是，研究人员还观察到，在 24 和 28 hAPF 时，近端翅膀区域的 Fz 稳定比例低于远端区域，但到 32 hAPF 时没有显著差异（图 1h）。总体而言，研究人员的结果揭示了在 24 - 28 hAPF 期间，近端翅膀中较高的组织应力各向异性与不太稳定的 Fz 之间的相关性，以及到 32 hAPF 时较高的 Fz 局部极性协调性。这与组织应力各向异性的一个重要作用是相对于组织轴定向核心蛋白极性的观点一致，较高的应力增加了局部协调性。
2.2 组织应力操纵对 Fz 极性和稳定性的影响
为了进行研究，“第一作者单位” 的研究人员采用物理操纵的方法，在 20 hAPF 时用镊子将翅膀叶片从铰链区域物理分离，以急性降低组织应力各向异性，这与先前的研究方法一致（图 2a）。切断的翅膀显示出各向异性组织应力降低，表现为与对照翅膀相比，28 hAPF 时肌球蛋白 II 极性显著下降（图 2b）。这导致与对照翅膀相比，细胞顶端面积和偏心率显著减小（补充图 2a - b’）。
到 32 hAPF 时，切断翅膀的组织应力各向异性与野生型翅膀没有显著差异（图 2b）。研究人员检查了应力各向异性降低的切断翅膀中 Fz 极性排列，并将其与 32 hAPF 翅膀毛发形成前的野生型翅膀进行比较。在切断的翅膀中，极性与 PD 轴的对齐较差（极性排列的角度方差较高），而野生型翅膀沿 PD 轴的对齐更一致（图 2a，c）。有趣的是，与完整的、未切断的对照翅膀相比，组织应力各向异性较低的切断翅膀表现出显著更高的 Fz 稳定比例（图 2d）。
同时，研究人员对蛹翅内的组织应力进行了基因操纵，并分析了其对 Fz 行为的影响。研究人员通过在 nubbin - Gal4（nub - Gal4）驱动子的控制下表达双链 RNA，降低了整个蛹翅中 Dumpy（Dpy）的水平，Dpy 是一种细胞外基质蛋白，将翅膀与其周围的角质层连接起来，并作为对抗铰链收缩的反作用力。Dpy 的缺失与翅膀中各向异性机械应力的降低有关，导致翅膀细胞顶端面积减小。随后，研究人员在 24 - 32 hAPF 期间评估了 dpy - RNAi 翅膀的细胞偏心率和组织应力各向异性（图 2e）。在 dpy - RNAi 翅膀中，从 24 到 32 hAPF，近端区域出现明显的表皮凹陷，这使得激光消融和活体成像研究变得具有挑战性。因此，研究人员将分析重点放在 dpy - RNAi 翅膀的远端区域，该区域在此期间保持平坦，并将其与野生型翅膀的相应区域进行比较。正如预期的那样，与对照野生型翅膀相同区域相比，24 hAPF 时 dpy - RNAi 翅膀中的细胞伸长较少，同时也表现出显著较低的组织应力各向异性，24 hAPF 时较低的肌球蛋白 II 极性证明了这一点（图 2e - h）。到 28 hAPF 及以后，dpy - RNAi 翅膀的细胞偏心率和组织应力各向异性与野生型翅膀没有显著差异（图 2e - h）。
然后，研究人员在 32 hAPF 翅膀毛发形成前，比较了应力各向异性降低的 dpy - RNAi 翅膀远端区域与对照野生型翅膀相同区域的 Fz 极性排列。在这个阶段，dpy - RNAi 翅膀的极性沿 PD 轴的排列较差，而对照翅膀则表现出更明显的 PD 定向极性排列（图 2i，j）。研究人员还证实，与对照翅膀的相应区域相比，dpy - RNAi 翅膀的其他区域表现出不太明显的 PD 定向极性（补充图 2c - d’）。通过使用标记有 mCherry 的普列克底物蛋白同源结构域标记物（PH::mCherry）检查 dpy - RNAi 翅膀和对照翅膀的翅膀毛状体方向，进一步验证了这些结果，dpy - RNAi 翅膀显示出漩涡状的毛状体模式（图 2i）。这些结果共同表明，组织应力各向异性在建立全局极性排列中起着关键作用，这与先前的发现一致。
此外，研究人员在 24 - 32 hAPF 期间，研究了对照野生型和 dpy - RNAi 翅膀相同区域的 Fz 稳定性。有趣的是，与对照野生型翅膀相比，组织应力各向异性较低的 dpy - RNAi 翅膀导致
