Gen抑制Wnt/Ca2+信号通路可减轻脑缺血再灌注损伤

　　

染料木黄酮（Gen）抑制 Wnt/Ca2?信号通路缓解脑缺血再灌注损伤的研究解读

蚌埠医学院病理生理学系的研究人员 Li Li 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Gen inhibiting the Wnt/Ca2? signaling pathway alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury” 的论文。该研究聚焦于脑缺血再灌注损伤（CIRI）这一急性缺血性中风（AIS）的严重并发症，深入探究了染料木黄酮（Gen）对其的治疗潜力，为中风治疗提供了新的潜在干预靶点和治疗方向，在脑血管疾病研究领域具有重要意义。

一、研究背景

缺血性中风约占所有中风病例的 80%，是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一。目前，溶栓治疗是急性缺血性中风患者的主要治疗方法，但恢复血流后会引发一系列级联反应，导致 CIRI。CIRI 通过多种病理机制，如氧自由基增加、炎症反应、钙超载和能量代谢受损等，破坏细胞内稳态，导致线粒体功能障碍，最终引发细胞死亡。因此，减轻 CIRI 的不良影响对缺血性中风的治疗至关重要。

研究表明，钙超载是 CIRI 发生和发展的关键机制之一。激活非经典的 Wnt/Ca2?信号通路可导致细胞内 Ca2?释放，其中 Frizzled - 2 作为 Frizzled 受体家族成员，其细胞外 N 端的半胱氨酸富集结构域（CRD）能特异性结合 Wnt 配体，启动 Wnt/Ca2?信号通路，在多种细胞功能中发挥重要作用。

Gen 是一种从大豆中提取的异黄酮化合物，因其结构与雌激素相似，具有多种生物学效应，如抗癌、抗氧化、抗炎等，还能通过下调细胞内钙水平保护神经元。然而，Gen 是否通过减轻钙超载来缓解 CIRI 及其具体机制尚不清楚。

二、研究材料与方法

（一）实验动物与分组

选用雄性 SPF 级 Sprague - Dawley（SD）大鼠，随机分为溶剂对照组（Vehicle）、脑缺血再灌注模型组（I/R）、Gen 预处理组（Gen - 25 mg/kg、Gen - 50 mg/kg、Gen - 100 mg/kg）、假手术组（Sham）、阴性对照组（NC）、Frizzled - 2 敲低组（Fzd2 - shRNA）。Gen 预处理组通过灌胃给予不同剂量的 Gen，持续 21 天，Vehicle 和 I/R 组给予等体积生理盐水。

（二）模型建立

1. 脑缺血再灌注模型：对成年雄性 SD 大鼠进行麻醉，暴露颈部血管，结扎右侧颈总动脉和颈外动脉，插入缝线阻塞大脑中动脉，缺血 2 小时后移除缝线恢复血流，再灌注 24 小时。
2. 氧糖剥夺 / 复氧（OGD/R）模型：使用大鼠嗜铬细胞瘤细胞系 PC12，在 96 孔板中用无葡萄糖 DMEM 培养基替换原培养基，置于三气培养箱（1% O?，5% CO?）中分别缺氧 3、6、9、12 小时，通过 CCK8 法确定最佳缺氧时间为 6 小时。实验分组包括对照组、OGD/R 组、Gen 预处理组（Gen - 10μM、Gen - 20μM、Gen - 30μM）、阴性对照组、Frizzled - 2 敲低组。Gen 预处理组在 OGD/R 诱导前 24 小时用不同浓度 Gen 预处理。

（三）干预措施

1. 腺相关病毒注射：在构建脑缺血再灌注模型前 21 天，将携带 Frizzled - 2 敲低的腺相关病毒（AAV）注入 SD 大鼠右侧脑室。
2. 慢病毒感染：将 PC12 细胞接种于 24 孔板，采用半体积感染法进行慢病毒转染，设定慢病毒（HANBIO）MOI 为 10，感染 48 小时后用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系。

（四）检测指标与方法

1. 行为学评分：采用 Longa 评分标准评估大鼠神经功能，选取评分 1 - 3 分的大鼠进行后续实验。
2. TTC 染色：用于测量脑梗死面积，计算梗死面积比。
3. 脑含水量测定：通过干湿重法计算脑含水量。
4. 定量实时 PCR（qRT - PCR）：检测相关基因 mRNA 表达。
5. Western blot：检测缺血半暗带组织和 PC12 细胞中相关蛋白表达。
6. 流式细胞术：检测 Ca2?水平、ROS 水平和细胞凋亡率。
7. 免疫荧光：检测组织和细胞中相关蛋白表达。
8. 其他检测方法：包括 DHE 和钙离子染色、TUNEL 染色、钙含量测定、MDA 和 SOD 活性测定等。

三、研究结果

（一）Gen 对脑缺血再灌注大鼠体重、梗死体积、水肿严重程度、神经功能缺损评分及病理变化的影响

通过对不同组大鼠体重监测，发现各 Gen 处理组与 Vehicle 组相比无显著差异。TTC 染色显示，I/R 组大鼠脑梗死面积显著大于 Vehicle 组，而 Gen 处理组梗死面积不同程度减小。神经功能缺损评分测试表明，I/R 组大鼠神经功能严重受损，Gen - 100 mg/kg 组较 I/R 组有明显改善。脑水肿结果显示，I/R 组脑水肿严重，Gen - 50 mg/kg 和 Gen - 100 mg/kg 组脑水肿减轻。HE 染色发现，I/R 组细胞结构紊乱、出现空泡化和核固缩碎裂，Gen 处理组这些病理变化不同程度缓解。

（二）Gen 对脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞钙离子水平的影响

利用免疫荧光和流式细胞术检测大鼠脑组织钙离子水平，结果显示 I/R 组较 Vehicle 组显著升高，Gen - 100 mg/kg 组较 I/R 组降低。对 PC12 细胞的检测也得到类似趋势，OGD/R 组钙离子水平高于对照组，Gen 组不同程度降低。

（三）Gen 对脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞氧化应激和凋亡的影响

免疫荧光结果显示，I/R 组大鼠脑组织 ROS 水平高于 Vehicle 组，Gen - 100 mg/kg 组降低。PC12 细胞中，OGD/R 组 ROS 水平升高，Gen - 20 μM 和 Gen - 30 μM 组显著降低。qPCR 结果表明，I/R 组 SOD1 和 SOD2 mRNA 表达降低，Gen - 100 mg/kg 组升高；I/R 组 NOX1 mRNA 表达升高，Gen - 100 mg/kg 组降低。免疫荧光和流式细胞术检测凋亡水平发现，I/R 组大鼠缺血半暗带组织和 PC12 细胞凋亡率升高，Gen - 100 mg/kg 组和 Gen 预处理的 PC12 细胞凋亡率降低。

（四）Wnt/Ca2?信号通路在脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞中的作用

Western blot 分析显示，I/R 组大鼠脑组织中 Wnt5a、Frizzled - 2、p - CaMKII 和 IP?R 蛋白表达高于 Vehicle 组，Gen - 100 mg/kg 组降低。PC12 细胞免疫荧光结果表明，OGD/R 组 Wnt5a 和 Frizzled - 2 表达升高，Gen - 30 μM 组降低。

（五）Frizzled - 2 的成功敲低

通过将靶向 Frizzled - 2 的腺相关病毒注入大鼠右侧脑室，21 天后成功建立脑缺血再灌注模型。体内成像显示病毒有效感染大鼠右半球，Western blotting 和定量 PCR 分析证实 Frizzled - 2 成功敲低。

（六）Frizzled - 2 敲低对脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞中 Wnt/Ca2?信号通路的影响

构建基于 Frizzled - 2 敲低的 I/R 模型，Western blotting 和免疫荧光检测发现，I/R 组 Wnt5a、Frizzled - 2、p - CaMKII 和 IP?R 蛋白表达升高，敲低 Frizzled - 2 后这些蛋白表达降低，PC12 细胞实验结果与之相符。

（七）Frizzled - 2 敲低对脑缺血再灌注损伤的影响

HE 染色显示，Sham 组脑组织染色均匀、细胞排列有序，I/R 组细胞排列紊乱、核浓缩深染、部分空泡变性坏死，敲低 Frizzled - 2 后病理损伤减轻。TUNEL 染色结果与之一致，且敲低 Frizzled - 2 可缓解 I/R 组氧化应激指标（ROS、MDA 升高，SOD 降低）和钙超载。

四、研究结论与讨论

研究表明，Gen 通过抑制 Wnt/Ca2?信号通路减轻 CIRI。在实验中，Gen 预处理可减小脑梗死面积、改善神经功能、减轻钙超载、氧化应激和细胞凋亡。机制上，Gen 下调 Wnt5a、Frizzled - 2 等 Wnt/Ca2?信号通路关键蛋白表达，抑制细胞内钙释放。敲低 Frizzled - 2 进一步证实该信号通路在介导钙超载损伤中的作用，敲低后可减轻 CIRI 相关病理变化。

急性缺血性中风恢复血流后引发的 CIRI 是治疗难题，目前缺乏有效干预措施。本研究首次明确 Gen 在 CIRI 中的作用及机制，为中风治疗提供新的潜在药物和干预靶点。然而，研究存在局限性，未探究 Gen 与抑制 Wnt/Ca2?信号通路双重干预对 CIRI 的影响。未来研究可在此基础上进一步深入，评估联合干预效果，优化治疗方案，推动中风治疗领域的发展，为临床治疗提供更有力的理论支持和实践指导。