Gen抑制Wnt/Ca2+信号通路可减轻脑缺血再灌注损伤

【字体: 时间:2025年02月08日 来源:Scientific Reports 3.8

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染料木黄酮(Gen)抑制 Wnt/Ca2?信号通路缓解脑缺血再灌注损伤的研究解读


蚌埠医学院病理生理学系的研究人员 Li Li 等人在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Gen inhibiting the Wnt/Ca2? signaling pathway alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury” 的论文。该研究聚焦于脑缺血再灌注损伤(CIRI)这一急性缺血性中风(AIS)的严重并发症,深入探究了染料木黄酮(Gen)对其的治疗潜力,为中风治疗提供了新的潜在干预靶点和治疗方向,在脑血管疾病研究领域具有重要意义。

一、研究背景


缺血性中风约占所有中风病例的 80%,是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一。目前,溶栓治疗是急性缺血性中风患者的主要治疗方法,但恢复血流后会引发一系列级联反应,导致 CIRI。CIRI 通过多种病理机制,如氧自由基增加、炎症反应、钙超载和能量代谢受损等,破坏细胞内稳态,导致线粒体功能障碍,最终引发细胞死亡。因此,减轻 CIRI 的不良影响对缺血性中风的治疗至关重要。

研究表明,钙超载是 CIRI 发生和发展的关键机制之一。激活非经典的 Wnt/Ca2?信号通路可导致细胞内 Ca2?释放,其中 Frizzled - 2 作为 Frizzled 受体家族成员,其细胞外 N 端的半胱氨酸富集结构域(CRD)能特异性结合 Wnt 配体,启动 Wnt/Ca2?信号通路,在多种细胞功能中发挥重要作用。

Gen 是一种从大豆中提取的异黄酮化合物,因其结构与雌激素相似,具有多种生物学效应,如抗癌、抗氧化、抗炎等,还能通过下调细胞内钙水平保护神经元。然而,Gen 是否通过减轻钙超载来缓解 CIRI 及其具体机制尚不清楚。

二、研究材料与方法


(一)实验动物与分组


选用雄性 SPF 级 Sprague - Dawley(SD)大鼠,随机分为溶剂对照组(Vehicle)、脑缺血再灌注模型组(I/R)、Gen 预处理组(Gen - 25 mg/kg、Gen - 50 mg/kg、Gen - 100 mg/kg)、假手术组(Sham)、阴性对照组(NC)、Frizzled - 2 敲低组(Fzd2 - shRNA)。Gen 预处理组通过灌胃给予不同剂量的 Gen,持续 21 天,Vehicle 和 I/R 组给予等体积生理盐水。

(二)模型建立


  1. 脑缺血再灌注模型:对成年雄性 SD 大鼠进行麻醉,暴露颈部血管,结扎右侧颈总动脉和颈外动脉,插入缝线阻塞大脑中动脉,缺血 2 小时后移除缝线恢复血流,再灌注 24 小时。
  2. 氧糖剥夺 / 复氧(OGD/R)模型:使用大鼠嗜铬细胞瘤细胞系 PC12,在 96 孔板中用无葡萄糖 DMEM 培养基替换原培养基,置于三气培养箱(1% O?,5% CO?)中分别缺氧 3、6、9、12 小时,通过 CCK8 法确定最佳缺氧时间为 6 小时。实验分组包括对照组、OGD/R 组、Gen 预处理组(Gen - 10μM、Gen - 20μM、Gen - 30μM)、阴性对照组、Frizzled - 2 敲低组。Gen 预处理组在 OGD/R 诱导前 24 小时用不同浓度 Gen 预处理。

(三)干预措施


  1. 腺相关病毒注射:在构建脑缺血再灌注模型前 21 天,将携带 Frizzled - 2 敲低的腺相关病毒(AAV)注入 SD 大鼠右侧脑室。
  2. 慢病毒感染:将 PC12 细胞接种于 24 孔板,采用半体积感染法进行慢病毒转染,设定慢病毒(HANBIO)MOI 为 10,感染 48 小时后用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系。

(四)检测指标与方法


  1. 行为学评分:采用 Longa 评分标准评估大鼠神经功能,选取评分 1 - 3 分的大鼠进行后续实验。
  2. TTC 染色:用于测量脑梗死面积,计算梗死面积比。
  3. 脑含水量测定:通过干湿重法计算脑含水量。
  4. 定量实时 PCR(qRT - PCR):检测相关基因 mRNA 表达。
  5. Western blot:检测缺血半暗带组织和 PC12 细胞中相关蛋白表达。
  6. 流式细胞术:检测 Ca2?水平、ROS 水平和细胞凋亡率。
  7. 免疫荧光:检测组织和细胞中相关蛋白表达。
  8. 其他检测方法:包括 DHE 和钙离子染色、TUNEL 染色、钙含量测定、MDA 和 SOD 活性测定等。

三、研究结果


(一)Gen 对脑缺血再灌注大鼠体重、梗死体积、水肿严重程度、神经功能缺损评分及病理变化的影响


通过对不同组大鼠体重监测,发现各 Gen 处理组与 Vehicle 组相比无显著差异。TTC 染色显示,I/R 组大鼠脑梗死面积显著大于 Vehicle 组,而 Gen 处理组梗死面积不同程度减小。神经功能缺损评分测试表明,I/R 组大鼠神经功能严重受损,Gen - 100 mg/kg 组较 I/R 组有明显改善。脑水肿结果显示,I/R 组脑水肿严重,Gen - 50 mg/kg 和 Gen - 100 mg/kg 组脑水肿减轻。HE 染色发现,I/R 组细胞结构紊乱、出现空泡化和核固缩碎裂,Gen 处理组这些病理变化不同程度缓解。

(二)Gen 对脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞钙离子水平的影响


利用免疫荧光和流式细胞术检测大鼠脑组织钙离子水平,结果显示 I/R 组较 Vehicle 组显著升高,Gen - 100 mg/kg 组较 I/R 组降低。对 PC12 细胞的检测也得到类似趋势,OGD/R 组钙离子水平高于对照组,Gen 组不同程度降低。

(三)Gen 对脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞氧化应激和凋亡的影响


免疫荧光结果显示,I/R 组大鼠脑组织 ROS 水平高于 Vehicle 组,Gen - 100 mg/kg 组降低。PC12 细胞中,OGD/R 组 ROS 水平升高,Gen - 20 μM 和 Gen - 30 μM 组显著降低。qPCR 结果表明,I/R 组 SOD1 和 SOD2 mRNA 表达降低,Gen - 100 mg/kg 组升高;I/R 组 NOX1 mRNA 表达升高,Gen - 100 mg/kg 组降低。免疫荧光和流式细胞术检测凋亡水平发现,I/R 组大鼠缺血半暗带组织和 PC12 细胞凋亡率升高,Gen - 100 mg/kg 组和 Gen 预处理的 PC12 细胞凋亡率降低。

(四)Wnt/Ca2?信号通路在脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞中的作用


Western blot 分析显示,I/R 组大鼠脑组织中 Wnt5a、Frizzled - 2、p - CaMKII 和 IP?R 蛋白表达高于 Vehicle 组,Gen - 100 mg/kg 组降低。PC12 细胞免疫荧光结果表明,OGD/R 组 Wnt5a 和 Frizzled - 2 表达升高,Gen - 30 μM 组降低。

(五)Frizzled - 2 的成功敲低


通过将靶向 Frizzled - 2 的腺相关病毒注入大鼠右侧脑室,21 天后成功建立脑缺血再灌注模型。体内成像显示病毒有效感染大鼠右半球,Western blotting 和定量 PCR 分析证实 Frizzled - 2 成功敲低。

(六)Frizzled - 2 敲低对脑缺血再灌注后大鼠脑组织和 PC12 细胞中 Wnt/Ca2?信号通路的影响


构建基于 Frizzled - 2 敲低的 I/R 模型,Western blotting 和免疫荧光检测发现,I/R 组 Wnt5a、Frizzled - 2、p - CaMKII 和 IP?R 蛋白表达升高,敲低 Frizzled - 2 后这些蛋白表达降低,PC12 细胞实验结果与之相符。

(七)Frizzled - 2 敲低对脑缺血再灌注损伤的影响


HE 染色显示,Sham 组脑组织染色均匀、细胞排列有序,I/R 组细胞排列紊乱、核浓缩深染、部分空泡变性坏死,敲低 Frizzled - 2 后病理损伤减轻。TUNEL 染色结果与之一致,且敲低 Frizzled - 2 可缓解 I/R 组氧化应激指标(ROS、MDA 升高,SOD 降低)和钙超载。

四、研究结论与讨论


研究表明,Gen 通过抑制 Wnt/Ca2?信号通路减轻 CIRI。在实验中,Gen 预处理可减小脑梗死面积、改善神经功能、减轻钙超载、氧化应激和细胞凋亡。机制上,Gen 下调 Wnt5a、Frizzled - 2 等 Wnt/Ca2?信号通路关键蛋白表达,抑制细胞内钙释放。敲低 Frizzled - 2 进一步证实该信号通路在介导钙超载损伤中的作用,敲低后可减轻 CIRI 相关病理变化。

急性缺血性中风恢复血流后引发的 CIRI 是治疗难题,目前缺乏有效干预措施。本研究首次明确 Gen 在 CIRI 中的作用及机制,为中风治疗提供新的潜在药物和干预靶点。然而,研究存在局限性,未探究 Gen 与抑制 Wnt/Ca2?信号通路双重干预对 CIRI 的影响。未来研究可在此基础上进一步深入,评估联合干预效果,优化治疗方案,推动中风治疗领域的发展,为临床治疗提供更有力的理论支持和实践指导。

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