犊牛和哺乳期奶牛接种H5禽流感灭活疫苗后体液免疫反应和乳抗体转移的评价

　　

牛用 H5 禽流感灭活疫苗免疫效果及牛奶抗体转移评估研究解读

埃及农业研究中心兽医生物制品评估中央实验室的 Mohamed Samy Abousenna、Nermeen G. Shafik 和 Mahmoud M. Abotaleb 等研究人员在《Scientific Reports》期刊上发表了题为 “Evaluation of humoral immune response and milk antibody transfer in calves and lactating cows vaccinated with inactivated H5 avian influenza vaccine” 的论文。该研究对于防控高致病性禽流感（HPAI）A (H5N1) 在牛群中的传播、保障畜牧业安全以及降低潜在的公共卫生风险具有重要意义。

一、研究背景

禽流感病毒（AIVs）因其广泛流行和高死亡率，给全球公共卫生系统带来严重威胁。依据静脉内致病性指数（IVPI）测试对鸡致病能力的不同，AIVs 分为高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV）。高致病性禽流感（HPAI）病毒，尤其是 HPAI H5N1 病毒，频繁传播至哺乳动物，对野生鸟类和家禽构成全球性威胁。2021 年末，北美检测到欧亚血统的 H5N1（clade 2.3.4.4b），引发的疫情持续到 2024 年，美国多种陆地和海洋哺乳动物出现感染和死亡病例。

2024 年 2 月，美国得克萨斯州狭长地带的奶牛出现一种综合征，表现为非特异性疾病、采食量和反刍减少、牛奶产量显著下降，患病奶牛的牛奶呈浓稠的乳黄色，类似初乳。该综合征在农场呈波浪式传播，发病率在发病后 4 - 6 天达到高峰，10 - 14 天内下降。多数动物随后恢复正常挤奶，但主要发生在多胎奶牛的泌乳中后期，发病率约 10 - 15%，死亡率较低。最初的诊断检查未能确定牛奶产量下降的明确原因，牛奶培养常为阴性，血清化学显示某些酶和胆红素水平轻度升高，血常规结果各异，部分动物出现贫血和白细胞减少。

2024 年 3 月初，疫情地理范围扩大，堪萨斯州西南部和新墨西哥州东北部的奶牛也出现类似临床表现，同时得克萨斯州狭长地带出现野生鸟类和家猫死亡。在得克萨斯州的奶牛场，喂食患病奶牛初乳和牛奶的家猫出现嗜睡、身体运动僵硬、共济失调、失明、转圈行为和大量眼鼻分泌物等症状，神经学检查显示威胁反应和瞳孔对光反射消失，仅存微弱眨眼反应。

2024 年 3 月 21 日和 22 日，爱荷华州立大学兽医诊断实验室收到来自得克萨斯州和堪萨斯州受影响奶牛场的样本，经检测确定致病原为高致病性禽流感 H5N1 病毒。对埃及鸟类宿主分离的 H5N1 毒株进行基因分析发现，其与 2021 - 2022 年欧洲、北美、亚洲和非洲流行的毒株高度同源，且存在与哺乳动物适应和毒力增强相关的基因标记，埃及野生鸟类中存在 clade 2.3.4.4b HPAI H5N1，增加了病毒传播到家禽和牛群，进而威胁人类健康的风险。

HPAI A (H5N1) 在禽类、家禽养殖场和包括牛在内的特定哺乳动物中的广泛传播，增加了人类暴露的可能性。厄瓜多尔和智利出现的由 HPAI H5N1 clade 2.3.4.4b 引起的人类严重疾病，凸显了某些 HPAI 毒株的大流行潜力。尽管美国疾病控制与预防中心（CDC）认为禽流感病毒对公众的风险较低，但职业或娱乐活动中接触感染鸟类和动物（包括牛）的人群感染 HPAI A (H5N1) 的风险更高。

当前禽流感感染的管理策略包括多方面，主要方法是扑杀感染家禽以防止病毒传播，疫苗接种在 AIV 控制中也起着关键作用。传统灭活疫苗虽可预防感染，但其有效性取决于与流行病毒株的遗传和抗原匹配度，而 AIV 的快速抗原进化限制了其效果。因此，研发对多种 AIV 毒株具有更广泛保护作用的新型疫苗至关重要。此外，生物安全措施，如严格的卫生协议、农场内和农场间的活动限制以及正确处理尸体和废料，对于预防 AIV 的引入和传播至关重要，监测计划的早期检测有助于及时干预和实施控制措施，减少疫情影响。

本研究旨在通过评估犊牛的剂量依赖性体液免疫反应和哺乳期奶牛的牛奶抗体转移情况，优化牛用 H5 禽流感灭活疫苗的剂量，确定产生强而持久免疫反应的最有效剂量，提高疫苗效力和抗体转移潜力。

二、研究材料与方法

（一）病毒

研究使用的 HPAI H5N1 病毒为 A/ibis/Egypt/RLQP - 229S/2022 (H5N1) 毒株，属于 clade 2.3.4.4b，由埃及动物健康研究所分离并测序（登录号 OP491851），后提供给兽医生物制品评估中央实验室。经二元乙撑亚胺（BEI）处理后作为血凝抑制（HI）抗原。

（二）疫苗

实验用 H5 禽流感疫苗（n = 1）此前经兽医生物制品评估中央实验室评估效果良好，是一种油佐剂灭活重配禽流感疫苗，由 H5N6 strain Re13（A/duck/Fujian/S1424/2020，来自 clade 2.3.4.4h）和 H5N8 strain Re14（A/whooper swan/Shanxi/4 - 1/2020，来自 clade 2.3.4.4b）两种毒株制备而成。

（三）动物分组与实验设计

研究在农业研究中心兽医生物制品评估中央实验室进行，经该中心机构动物护理和使用委员会（ARC - IACUC）批准。选用 22 头 6 - 8 个月大的埃及本土 Baladi（Menufi 品种）犊牛，用 ID Screen ELISA 流感 A 抗体竞争多物种试验筛选出血清阴性犊牛后，分为 5 组。其中，1 - 4 组犊牛分别皮下注射不同剂量疫苗（1 组 4 个田间剂量，2ml / 个；2 组 6 个田间剂量，3ml / 个；3 组 8 个田间剂量，4ml / 个；4 组 12 个田间剂量，6ml / 个），6 组 2 头犊牛作为未接种疫苗的阴性对照组。所有动物分开饲养，观察疫苗不同剂量的免疫反应。

3 头哺乳期埃及本土奶牛（Menufi 品种，5 组）在 1 - 4 组犊牛接种疫苗 4 周后，皮下注射 4 个田间剂量（2ml / 个）的疫苗，评估牛奶抗体转移情况。

（四）安全性观察

接种不同剂量疫苗的动物均接受临床观察，记录异常情况，仔细检查注射部位有无不良反应，每日测量体温（从接种前 4 天开始至疫苗效力研究结束）。

（五）样本采集与检测

1 - 4 组和 6 组犊牛每周从颈静脉采血，共 6 周，分离血清进行 HI 试验和 ID Screen ELISA 流感 A 抗体竞争多物种试验。5 组奶牛每周采集牛奶和血清样本，直至检测到抗体，用 ID Screen ELISA 流感 A 抗体竞争多物种试验分析样本中抗体的存在和从血清到牛奶的转移情况。

（六）伦理审批

研究遵循《动物研究：体内实验报告》（ARRIVE）指南，所有动物实验程序严格遵守农业研究中心机构动物护理和使用委员会的规定，获得该委员会批准（批准号 ARC - CLEVB - 98 - 24），符合生物伦理标准。

（七）统计分析

使用 Python 和 SciPy（版本 1.14.0）进行统计分析，采用 Friedman 检验评估 1 - 4 组接种疫苗组 HI 值的差异。

三、研究结果

（一）安全性观察

1 - 2 组犊牛（2mL 和 3mL 剂量）未出现不良反应，行为和采食正常；3 组犊牛（4mL 剂量）注射部位出现轻度至中度无菌炎症，接种后第 3 天出现肿胀，1 个月内自行消退；4 组犊牛（6mL 剂量）出现类似 3 组的中度无菌炎症，无全身反应；6 组未接种疫苗的对照组犊牛无不良反应，表明实验条件安全。5 组哺乳期奶牛（2mL 剂量）接种疫苗后无明显异常，行为正常，牛奶产量不受影响。

（二）体液免疫反应

1. HI 试验：HI 试验结果显示，疫苗接种后的抗体滴度呈剂量依赖性。接种后第 1 周，1 - 4 组犊牛的 HI 抗体滴度分别为 4、5、5、6 log?；第 2 周，所有接种组抗体滴度显著增加，4 组达到最高 9 log?，1 组达到 6 log?；第 3 - 6 周，抗体滴度趋于平稳，4 组维持 9 log?的峰值，1 组稳定在 6 log?，2 组和 3 组分别维持在 7 log?和 8 log?，未接种组始终无抗体反应。Friedman 检验表明，各组间存在显著差异（p = 0.0018，χ2 = 15）。
2. ELISA 试验（血清样本）：ELISA 试验结果进一步证实了体液免疫反应。接种后第 1 周，1 组血清样本未检测到抗体（-），2 - 4 组阳性水平逐渐增加（+、++、+++）；第 2 周，所有接种组均呈现强烈抗体反应，1 组达到强阳性（++），4 组血清中阳性水平最高（++++），对照组仍为阴性（-）；第 3 - 6 周，1 - 4 组抗体水平保持稳定（++ 至 ++++）。

（三）牛奶抗体转移

5 组哺乳期奶牛接种疫苗后，第 1 周血清样本抗体检测为阴性，牛奶样本结果可疑；第 2 周，血清样本呈阳性，牛奶样本在 ID ELISA 检测中呈现强阳性反应，表明疫苗可诱导牛奶抗体转移，且 ID ELISA 检测牛奶样本中 AIV 抗体的敏感性高于血清样本。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究表明，H5 禽流感疫苗在牛体内可诱导强烈的剂量依赖性免疫反应，较高剂量可产生更强且更持久的抗体反应。即使较低剂量也能提供显著的抗体保护，达到鸡体内确定的 5 - 7 log?的保护范围内的滴度。HI 试验和 ELISA 试验结果相互印证，所有接种组在接种后早期均产生快速且高水平的抗体反应，且在实验期间保持稳定。此外，研究观察到哺乳期奶牛的牛奶抗体有效转移，表明疫苗不仅能引发全身免疫反应，还能通过牛奶转移抗体。

（二）讨论

美国奶牛中检测到 HPAI A (H5N1)，凸显了加强监测和生物安全措施以防止病毒传播和保障人类健康的紧迫性。本研究评估了不同剂量 H5 禽流感灭活疫苗对牛的效力和牛奶抗体转移情况，为优化疫苗剂量和配方提供了重要依据。

在安全性方面，1 - 2 组的疫苗剂量（2ml（4x）和 3ml（6x））对牛整体安全，3 - 4 组较高剂量虽出现局部炎症反应，但未影响牛奶生产和动物体温，为确定安全有效的疫苗剂量范围提供了参考。

与其他研究对比，本研究中牛对 H5 禽流感疫苗的免疫反应与对其他疫苗（如口蹄疫病毒疫苗和疙瘩皮肤病病毒疫苗）的反应存在差异。可能原因包括 H5 禽流感疫苗的佐剂和抗原组成更能有效诱导牛产生强而稳定的免疫反应；其免疫原性在牛体内更高，促使抗体产生更强劲；H5 禽流感病毒本身触发的免疫机制不同，导致产生独特且更有效的抗体反应。此外，本研究中观察到的剂量依赖性反应强调了优化疫苗剂量的重要性，较高剂量的 H5 禽流感疫苗免疫效果更好，这对其他疫苗的研究也有借鉴意义。

研究也存在局限性，如使用的是禽用 AIV 疫苗，每组动物数量虽满足统计分析，但样本量增加可提供更可靠数据。未来研究应深入探讨影响牛用 AIV 疫苗配方的因素，如佐剂和抗原含量，延长接种后监测期，探索不同疫苗配方，以更全面了解牛的免疫反应和疫苗效力，优化牛群疫苗接种策略，提高对 AIV 的防护能力。

综上所述，本研究为牛用 H5 禽流感疫苗的应用和改进提供了关键信息，对于防控禽流感在牛群中的传播、保障畜牧业健康发展以及降低潜在公共卫生风险具有重要意义，后续研究方向明确，有望进一步完善牛群的禽流感防控策略。