通过代谢工程构建乙酰辅酶A转移酶过表达菌株揭示结核分枝杆菌对贝达喹啉耐药的ATP调控机制

为解决结核病治疗中贝达喹啉(BDQ)耐药性问题，日本长崎大学团队通过将锥虫乙酰辅酶A转移酶(ASCT)导入耻垢分枝杆菌，首次证实低浓度BDQ的抑菌作用与ATP水平直接相关。该研究发表于《Communications Biology》，为开发新一代ATP合酶抑制剂提供了新思路。

　　

结核病(TB)作为全球第二大传染病杀手，每年导致数百万人死亡。随着多药耐药结核(MDR-TB)和广泛耐药结核(XDR-TB)的出现，世界卫生组织将贝达喹啉(BDQ)列为核心治疗药物。然而这种靶向F型ATP合酶的抑制剂面临两大挑战：治疗窗狭窄导致的副作用，以及日益严重的临床耐药问题。更令人困惑的是，即使存在可通过糖酵解产生ATP的发酵性碳源，BDQ仍能有效抑制分枝杆菌生长，暗示其作用机制存在未解之谜。

日本长崎大学热带医学研究所(Nagasaki University Institute of Tropical Medicine)的研究团队独辟蹊径，从锥虫独特的能量代谢中获得灵感。锥虫通过乙酰辅酶A转移酶/琥珀酰辅酶A合成酶(ASCT/SCS)循环，可在不依赖氧气的条件下高效产生ATP。研究人员将克氏锥虫(TcASCT)和布氏锥虫(TbASCT)的ASCT基因导入模式菌株耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)，构建了能通过底物水平磷酸化(SLPHOS)额外产生ATP的工程菌株。

研究主要采用蛋白质纯化技术获得高活性TcASCT酶，通过96孔板生长曲线分析和REMA法测定药物敏感性，结合BacTiter-Glo^TM检测胞内ATP水平。来自刚果民主共和国的临床样本提供了结核菌株对照。

关键研究发现：

1. 酶学特性突破：首次纯化的TcASCT在37℃保持最佳活性（与人体温度一致），其k_cat值显著高于细菌ATP合酶，为代谢工程奠定基础。

2. 生长救援现象：在含1-7 ng/mL BDQ的培养基中，ASCT工程菌的生长速率显著高于对照菌（p≤0.05），

   
   。但9 ng/mL时所有菌株均被完全抑制，表明高浓度BDQ存在其他致死机制。

3. 碳源依赖性：在葡萄糖培养基中ASCT救援效果最显著，而甘油培养的菌株对BDQ最敏感，揭示能量代谢网络的复杂调控。

4. ATP水平证据：在3 ng/mL BDQ作用下，TcASCT菌株ATP含量比对照高3倍（p<0.01），

   
   ，直接证实ATP水平与BDQ敏感性相关。

5. 时间效应：5天暴露后，TcASCT菌株的GI₅₀值升至24.2 ng/mL，是对照菌(3.6 ng/mL)的7倍，说明ASCT介导的是渐进式耐受而非即时耐药。

这项研究首次将锥虫代谢通路成功移植到分枝杆菌，揭示了BDQ在低浓度时通过耗竭ATP抑制生长的明确机制。特别值得注意的是，ASCT/SCS循环提供的ATP足以抵抗临床相关浓度(1-5 ng/mL)的BDQ，这为开发针对ATP合成双途径的联合疗法提供了理论依据。论文通讯作者Daniel Ken Inaoka指出，该发现不仅解释了BDQ的浓度依赖性作用差异，更为重要的是，为克服现有ATP合酶抑制剂的局限性提供了全新策略——同时靶向OXPHOS和SLPHOS可能成为对抗耐药结核的突破口。

这项发表于《Communications Biology》的研究，通过跨物种代谢工程解决了微生物药物耐药性研究的重大难题，其创新性体现在三个方面：一是发现ATP水平是决定BDQ效价的关键因素；二是建立了可量化评估药物-能量代谢关系的模型系统；三是为"代谢弱点"靶向疗法提供了新范式。这些发现将对下一代抗结核药物的研发产生深远影响。