马链球菌Cas9增强基因组编辑

SeqCas9是一种来自链球菌家族的Cas9变体，它识别出一种简单的NNG PAM，具有高活性和增强的特异性，突出了其作为基因编辑应用的高效和精确工具的潜力。

　　

马链球菌 Cas9 助力基因组编辑新突破：拓展靶向范围，提升编辑效能

近期，复旦大学附属浦东医院、中山医院等单位的研究人员在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Enhanced genome editing with a Streptococcus equinus Cas9” 的研究论文。该研究在基因组编辑领域具有重要意义，为解决传统 SpCas9 存在的局限性提供了新的方向和工具，有望推动基因组编辑技术在基础研究、疾病治疗等多个领域的进一步发展。

一、研究背景

在基因组编辑技术的发展历程中，源自化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的 SpCas9 发挥了开创性作用，是最早应用于基因组编辑的 Cas9 核酸酶。凭借其显著的活性，SpCas9 成为了基因组编辑工具的基石。然而，SpCas9 在实际应用中存在诸多问题。其一，它在某些基因位点的编辑效率较低，难以满足精准高效的编辑需求；其二，脱靶效应严重，可能导致非预期的基因改变，影响实验结果的准确性和安全性；其三，SpCas9 对 PAM（protospacer adjacent motif）序列要求严格，局限于识别 NGG PAM，极大地限制了其靶向范围。此外，在碱基编辑方面，基于 SpCas9 的碱基编辑器在部分位点的编辑效率欠佳，且一些为碱基编辑量身定制的紧凑型 Cas9 核酸酶，编辑窗口过宽，容易引发不必要的核苷酸转换。

随着基因组编辑技术的深入研究，大量与 SpCas9 密切相关的直系同源物被通过计算机技术识别出来。研究人员推测，开发和利用这些同源物，有可能克服 SpCas9 的局限性。在此背景下，该研究团队开展了对 SpCas9 直系同源物的研究，旨在挖掘具有更优性能的基因组编辑工具。

二、研究材料与方法

（一）实验材料

研究选用多种细胞系，如 HEK293T 细胞作为主要研究对象，细胞培养所需的试剂，包括培养基、血清、抗生素等均购自 Gibco 公司。实验中涉及众多质粒，如用于表达 Cas9 及其直系同源物的质粒、用于表达 sgRNA 的质粒等，这些质粒部分通过合成、部分从 Addgene 获取，并经一系列分子生物学操作进行构建和改造。此外，还用到了多种酶类，如用于 DNA 组装的 NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit、用于 DNA 提取的相关试剂盒等。

（二）实验方法

1. 质粒构建：对 SpCas9 直系同源物进行人工合成并优化密码子，使其更适配人类细胞表达。以常用质粒为模板，通过 PCR 扩增相关片段，再利用 NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit 将目的片段与质粒骨架重组，构建出表达 Cas9 直系同源物的质粒，如 pX459-Cas9。同理构建用于碱基编辑的质粒，像 pCMV-SeqABE-P2A-Puro 和 pCMV-SeqCBE-P2A-Puro 等。
2. 细胞培养与转染：将 HEK293T 细胞培养在添加 10% 热灭活胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，置于 37°C、5% CO?的培养箱中培养。根据不同实验目的，在细胞达到特定融合度时，使用聚乙烯亚胺（PEI）转染试剂将相应的质粒转染到细胞中。
3. 活性与特异性检测：运用 GFP 激活试验筛选具有编辑活性的 Cas9 直系同源物并鉴定其 PAM 序列。该实验通过在 GFP 编码序列中插入靶序列和随机序列，使 GFP 表达中断，若 Cas9 核酸酶能切割靶序列，恢复 GFP 读码框，细胞就会表达 GFP，从而筛选出有活性的 Cas9。利用深度测序技术分析编辑效率和特异性，通过设计含单核苷酸错配的 sgRNA，转染细胞后测序评估不同 Cas9 对错配的敏感性。同时，采用 GUIDE - seq 技术在全基因组水平评估 Cas9 的特异性，检测脱靶位点。
4. 碱基编辑能力评估：构建基于 SeqCas9 的碱基编辑器 SeqABE 和 SeqCBE，设计针对不同 PAM 序列位点的 sgRNA，转染细胞后，经嘌呤霉素筛选，提取基因组 DNA，通过巢式 PCR 扩增靶位点，纯化后进行深度测序，以此评估碱基编辑效率和编辑窗口。
5. LNP 递送实验：将 SeqCas9 mRNA 和 sgRNA 按 1:1 重量比共包装到脂质纳米颗粒（LNP）中，转染 HEK293T 细胞，培养一段时间后提取基因组 DNA，经 PCR 构建文库和凝胶纯化，再进行深度测序，评估 LNP 递送 SeqCas9 的编辑效率。

三、研究结果

（一）SpCas9 直系同源物的选择

研究人员从 NCBI 的基因数据库中，依据 SpCas9 序列搜索相关直系同源物，精心挑选出 18 种进行深入研究。这些同源物的氨基酸序列与 SpCas9 的一致性在 30.98% - 86.03% 之间。对 PAM 相互作用结构域中关键氨基酸 R1333 和 R1335 的分析显示，11 种同源物有单个位点变异，7 种有两个位点变异，这种多样性为研究 PAM 序列的差异提供了丰富素材。

（二）SpCas9 直系同源物 PAM 的分析

运用 GFP 激活试验筛选有编辑活性的 Cas9 同源物，结果发现 10 种能诱导 GFP 表达。对 GFP 阳性细胞的靶序列进行深度测序，生成 WebLogos 和 PAM wheels，发现这些 Cas9 同源物大多偏好富含嘌呤的 PAM 序列。其中，SpCas9 靶向 NGG PAM，Dpi2Cas9 偏好 NGA PAM，SeqCas9、Slu1Cas9 和 Slu2Cas9 对 NRG（R = A 或 G）PAM 有强烈偏好。鉴于这 4 种识别二核苷酸 PAM 的 Cas9 同源物具有特殊研究价值，研究人员后续对它们展开重点研究。

（三）SpCas9 直系同源物活性测试

通过序列比对确定了 Cas9 同源物的直接重复序列和 tracrRNA 序列，并构建了适配的 sgRNA 支架。实验表明，这些 Cas9 同源物与自身的 sgRNA 支架结合时，活性显著高于与 SpCas9 的 sgRNA 支架结合的情况。在多个内源性位点对 SeqCas9、Slu1Cas9、Slu2Cas9 与 SpCas9、SpCas9 - HF1、SpRY 的活性进行比较，发现整体活性排序为 SpCas9 > SpRY > SeqCas9 > SpCas9 - HF1 > Slu1Cas9 > Slu2Cas9。进一步优化 SeqCas9 活性时发现，20 - nt 的间隔序列在多个位点表现出较高活性，因此选定其用于后续实验。在不同 PAM 序列的内源性位点测试中，SeqCas9 在 NAG、NCG 和 NTG PAM 位点的活性优于 SpCas9 和 SpCas9 - NG。

（四）SpCas9 直系同源物特异性测试

针对不同 Cas9 同源物设计含单核苷酸错配的 sgRNA 进行编辑实验，深度测序结果显示，不同 Cas9 对单核苷酸错配的敏感性存在差异。综合评估，SeqCas9 的特异性较强，在特异性排名中位居前列。利用 GUIDE - seq 技术对 SpCas9、SpCas9 - HF1 和 SeqCas9 进行全基因组特异性分析，结果表明，在靶向 AAVS1 位点时，SpCas9 诱导了 6 个脱靶位点，而 SpCas9 - HF1 和 SeqCas9 未检测到脱靶位点，充分证明了 SeqCas9 具有较高的天然特异性。

（五）SeqCas9 的碱基编辑

构建基于 SeqCas9 的碱基编辑器 SeqABE 和 SeqCBE，分别针对含 NAG、NCG 和 NTG PAM 的内源性位点设计 sgRNA 进行碱基编辑实验。结果显示，SeqABE 在多个位点实现了高效的 A 到 G 转换，编辑效率优于 ABEmax - NRRH 和 ABEmax - NG；SeqCBE 在多个位点成功实现 C 到 T 转换，同样展现出比 AncBE4max - NRRH 和 AncBE4max - NG 更优的编辑效果。此外，在对 PCSK9 基因的剪接供体和受体进行碱基编辑实验中，SeqABE 在部分位点的表现优于 ABEmax - NG，凸显了其在心血管疾病相关研究中的潜在治疗价值。利用 LNP 递送 SeqCas9 mRNA 和 sgRNA 的实验表明，LNP 能够有效将其递送至 HEK293T 细胞并实现基因组编辑，最高编辑效率可达 59.9%。

四、研究结论与讨论

该研究成功鉴定出 10 种 SpCas9 直系同源物的 PAM 序列，拓展了对 Cas9 家族 PAM 多样性的认知。研究发现这些同源物偏好富含嘌呤的 PAM 序列，这与之前对其他 Cas9 系统的研究结果相互印证，同时也体现出不同 Cas9 系统在 PAM 识别上的差异，为开发具有更广泛靶向能力的基因组编辑工具提供了重要依据。

SeqCas9 作为一种新发现的 Cas9 变体，能够识别简单的 NNG PAM，其特异性和活性与高保真版本的 SpCas9 - HF1 相当。在碱基编辑方面，基于 SeqCas9 的碱基编辑器展现出与基于 SpCas9 的碱基编辑器相近的狭窄编辑窗口，具备精准碱基编辑的能力，且在多个内源性位点的碱基编辑效率高于 SpCas9 - NG 和 SpCas9 - NRRH，凸显了 SeqCas9 在基因组编辑应用中的潜在优势，有望成为一种高效且精准的基因组编辑工具。

研究还证实了 LNP 能够成功递送 SeqCas9 进行基因组编辑，为其在体内的应用提供了可能。不过，研究也存在一定局限性，例如 SeqCas9 与部分其他 Cas9 变体识别的 PAM 不同，未来需要与更多识别相同 PAM 的 Cas9 变体进行直接比较，以更全面地评估 SeqCas9 的特性和应用潜力。

总体而言，该研究成果为基因组编辑技术的发展注入了新活力。SeqCas9 的发现和特性研究，为科研人员在基因组编辑实验设计中提供了更多选择，有助于解决传统 SpCas9 在编辑效率、特异性和靶向范围等方面的问题，在基因功能研究、疾病模型构建、基因治疗等领域具有广阔的应用前景，有望推动基因组编辑技术迈向新的高度，为生命科学研究和医学发展带来新的突破。