核受体NR2F6对NK细胞发育、成熟和抗肿瘤反应的调控

　　

核受体 NR2F6 对 NK 细胞发育、成熟及抗肿瘤反应的调控研究解读

奥地利因斯布鲁克医科大学细胞遗传学研究所的 Johannes Woelk、Florian Hornsteiner、Stephanie Aschauer-Wallner 等研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Regulation of NK cell development, maturation, and antitumor responses by the nuclear receptor NR2F6” 的论文。该研究深入探讨了核受体 NR2F6 在 NK 细胞发育、成熟及抗肿瘤反应中的关键调控作用，为肿瘤免疫治疗提供了新的潜在靶点和理论依据，对推动免疫肿瘤学领域的发展具有重要意义。

一、研究背景

自然杀伤（NK）细胞在调节微生物感染、肿瘤监视、同种异体移植排斥、妊娠和自身免疫反应等过程中发挥着关键作用。其固有的抗肿瘤活性使其成为免疫肿瘤学治疗的重要靶点。NK 细胞功能受多种表面受体调节，其中自然细胞毒性受体（NCRs）能诱导 NK 细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，NKp46 作为 NCRs 成员，在肿瘤清除中起重要作用，但其上游调节因子尚不清楚。

同时，NK 细胞可产生促炎细胞因子和趋化因子，影响树突状细胞（DCs）等的招募和成熟；NK 细胞也需通过辅助细胞的刺激来获得功能，IL-15 的转呈对 NK 细胞的存活和增殖至关重要，已应用于癌症临床试验。

核受体 NR2F6 属于核受体家族，参与调节炎症过程，此前研究已证实其在 T 淋巴细胞中具有重要功能，但在 NK 细胞中的功能尚未被研究。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

选用 C57BL/6 背景的 Nr2f6 基因敲除小鼠和野生型小鼠，年龄为 8 - 12 周，实验时进行年龄和性别匹配，动物实验程序经奥地利联邦教育、科学和研究部批准。

（二）实验技术与操作

1. 组织采样：对小鼠的脾脏、血液和骨髓等组织进行采样处理，如脾脏经细胞滤网匀浆，血液通过动脉或静脉采集，骨髓从股骨和胫骨提取等。
2. 流式细胞术：用于检测细胞表面标志物及细胞内细胞因子，通过特定抗体对细胞进行染色分析。
3. NK 细胞分离与体外培养：利用小鼠 NK 细胞分离试剂盒从脾细胞中分离 NK 细胞，在含有不同细胞因子的培养基中进行体外培养。
4. NK 细胞刺激：对分离的 NK 细胞或脾细胞进行刺激，如使用 IL-12、IL-18、α-NKp46 或与 B16 细胞共培养等方式。
5. 染色质免疫沉淀（ChIP）：用于研究 NR2F6 与 Ncr1 启动子的结合情况。
6. 体内 NK 细胞激活和 IFN-γ 分泌检测：通过静脉注射 LPS 激活体内 NK 细胞，检测 IFN-γ 的释放。
7. IL-15 复合物处理：给小鼠静脉注射 IL-15 复合物或 PBS，观察对 NK 细胞的影响。
8. 细胞分选和 RNA 制备：利用 FACS Aria III 对脾 NK 细胞进行分选，提取 RNA 并进行测序分析。
9. 数据分析：使用 Prism 10.2.3 进行统计分析，评估数据的正态分布和方差差异，采用不同的检验方法进行组间比较。

三、研究结果

（一）Nr2f6 基因敲除小鼠外周 NK 细胞中 NKp46 表达显著增强

通过对野生型和 Nr2f6 基因敲除小鼠脾 CD3?NK1.1?NKp46?CD49b?NK 细胞进行 RNA 测序分析，发现 Nr2f6 基因敲除小鼠中包括 Ncr1（编码 NKp46）在内的多个基因表达上调，同时一些基因表达下调。通过流式细胞术检测发现，Nr2f6 基因敲除小鼠脾和血液中 NKp46 表达水平及 DNAM-1? NK 细胞频率显著升高，且体外培养的 Nr2f6 基因敲除小鼠 NK 细胞在不同刺激条件下 NKp46 水平均高于野生型。此外，ChIP 实验证实 NR2F6 可结合到 Ncr1 启动子的 - 912bp 位点，表明 NR2F6 负向调控 Ncr1 基因表达。

（二）NR2F6 缺失阻碍外周 NK 细胞成熟和短期效应反应

在脾脏和血液中，Nr2f6 基因敲除小鼠的未成熟 NK 细胞比例增加，成熟和终末成熟 NK 细胞比例显著下降。在体内短期 LPS 驱动的炎症模型中，Nr2f6 基因敲除小鼠 NK 细胞产生 IFNγ 的频率、细胞数量和表达水平均显著低于野生型，尽管 NKp46 表达仍较高。这表明 NR2F6 缺失导致外周 NK 细胞成熟和短期效应反应受损。

（三）Nr2f6 基因敲除小鼠骨髓来源的 NK 细胞中 NKp46 表达增强

分析小鼠骨髓中 NK 细胞发育过程，发现野生型和 Nr2f6 基因敲除小鼠的共同淋巴祖细胞（CLP）、前 NK 前体（NKPs）和精制 NK 前体（rNKPs）的频率和细胞数量相似，NK 细胞发育阶段 A、B、C 的比例和细胞数量也相似，但在阶段 C，Nr2f6 基因敲除小鼠 CD3NK1.1?细胞的 NKp46 表达显著升高，且骨髓中 NK 细胞的成熟过程在两种基因型之间无差异。说明在骨髓中，NR2F6 缺失不影响 NK 细胞祖细胞群体和成熟，但增强了 NKp46 的表达。

（四）Nr2f6 基因敲除小鼠的髓系细胞区室缺陷阻碍外周 NK 细胞成熟

对小鼠脾脏髓系细胞区室进行分析，发现 Nr2f6 基因敲除小鼠中交叉呈递的 XCR1? cDC1s 频率显著降低，DCs 上 IL-15Rα 的表达也降低；Nr2f6 基因敲除小鼠的 CD11b1?????F4/80?巨噬细胞数量减少，但巨噬细胞上 IL-15Rα 表达与野生型相似。体外实验表明，Nr2f6 基因敲除小鼠的 NK 细胞在 IL-12 + IL-18 刺激下 IFNγ 和 TNFα 反应降低，在 NKp46 激活或与 B16 肿瘤细胞共培养时 IFNγ 产生增加。这表明脾脏髓系细胞区室的缺陷减少了 NK 细胞的 IL-15 启动，进而影响了 Nr2f6 基因敲除小鼠 NK 细胞的成熟和效应反应。

（五）体内克服 IL-15 限制可使 Nr2f6 基因敲除小鼠的 NK 细胞充分发育成熟

给 Nr2f6 基因敲除小鼠注射 IL-15 复合物（IL-15C）后，其脾脏和血液中的 NK 细胞数量增加，频率升高，NKp46 表达仍然较高，且 IL-15C 处理使 Nr2f6 基因敲除小鼠的 NK 细胞成熟正常化，终末成熟的 CD11b?KLRG1? NK 细胞频率显著增加，超过野生型水平。RNA 测序分析显示，IL-15C 处理后，Nr2f6 基因敲除小鼠的 NK 细胞中一些促进抗肿瘤反应的基因表达上调，如 Perf1、Stat5a、Zeb2 等，同时一些检查点抑制剂基因表达下调。体外培养发现，IL-15C 处理的 Nr2f6 基因敲除小鼠脾细胞在刺激后，NK 细胞产生 IFNγ、穿孔素和颗粒酶 B 的能力显著增强。

（六）NR2F6 缺失可抑制 B16 - F10 - B2m 黑色素瘤肺转移形成

在 B16 - F10 - B2m 黑色素瘤肺转移模型中，Nr2f6 基因敲除小鼠的肺转移瘤形成显著减少。给予 IL-15C 预处理后，Nr2f6 基因敲除小鼠的转移瘤形成进一步减少。肿瘤浸润、血液和脾脏中的 NK 细胞频率在两种基因型之间相似，但 Nr2f6 基因敲除小鼠的 NK 细胞中 NKp46 水平始终较高，且在血液和肿瘤中，终末成熟的 CD27CD11b?KLRG1? NK 细胞频率恢复到野生型水平。表明在 MHC-I 缺陷的肺转移排斥中，Nr2f6 基因敲除小鼠的 NK 细胞功能优于野生型。

四、研究结论与讨论

该研究表明，NR2F6 是 Ncr1 基因表达的负调节因子，NR2F6 缺失导致骨髓来源、外周、肿瘤浸润和体外扩增的 NK 细胞中激活受体 NKp46 表达显著增强。在稳态条件下，Nr2f6 基因敲除小鼠中 cDC1s 和脾巨噬细胞数量减少，导致 IL-15 转呈减少，进而引起 NK 细胞成熟缺陷；而 IL-15C 处理可上调促进抗肿瘤 NK 细胞反应的基因表达，同时下调检查点抑制剂基因表达，使 Nr2f6 基因敲除小鼠的 NK 细胞在肿瘤免疫监视中表现出更强的功效。

此外，此前研究发现缺失 NR2F6 可增强 T 细胞的抗肿瘤反应，尤其是在免疫检查点抑制期间。本研究进一步表明，在 NK 细胞中缺失 NR2F6 对于缺乏有效 T 细胞表位或下调 MHC-I 表达以逃避免疫监视的肿瘤可能具有重要意义，为联合治疗干预提供了潜在途径。然而，NKp46 表达增强在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）中的作用仍有待进一步研究，需要深入探讨 NK 细胞上 NKp46 表达增强与 SLE 等自身免疫性疾病进展之间的关系。

总体而言，该研究揭示了 NR2F6 在 NK 细胞生物学中的重要调控作用，为肿瘤免疫治疗提供了新的潜在靶点和理论基础，有望推动相关治疗策略的进一步发展。