基于共价肽的肿瘤免疫治疗溶酶体靶向蛋白降解平台

　　

基于共价肽的溶酶体靶向蛋白降解平台用于癌症免疫治疗

摘要：溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）策略为膜蛋白降解提供了强大工具。然而，LYTAC（抗体 - 小分子偶联物）的合成颇具挑战，基于抗体的 LYTAC 穿透实体瘤的能力也有限，尤其是难以穿过血脑屏障（BBB）。在此，中山大学深圳校区药学院（深圳）的研究人员提出了一种基于共价嵌合肽的靶向降解平台（Pep - TACs），通过引入长而灵活的芳基磺酰氟基团，使其在与目标蛋白结合时能够实现邻近交联。Pep - TACs 平台借助转铁蛋白受体（TFRC）介导的溶酶体靶向内吞机制，促进目标蛋白的降解。生物学实验表明，共价 Pep - TACs 能显著降低肿瘤细胞、树突状细胞和巨噬细胞上程序性死亡配体 1（PD - L1）的表达，在酸性条件下效果尤为显著，同时还能显著增强 T 细胞功能以及巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用。此外，在抗程序性死亡受体 1（PD - 1）敏感和耐药的肿瘤模型中，Pep - TACs 均能引发显著的抗肿瘤免疫反应。值得注意的是，Pep - TACs 能够穿过血脑屏障，延长原位脑肿瘤小鼠的生存期。作为概念验证，本研究引入了一种基于 TFRC 的模块化共价肽降解平台，用于膜蛋白降解，尤其是脑肿瘤的免疫治疗。

一、引言

近年来，靶向蛋白降解（TPD）技术，包括分子胶、蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）、降解标签（dTAGs）等，作为具有前景的治疗方法应运而生，这些技术依赖于泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）的激活来降解细胞内蛋白。然而，目前相当一部分膜蛋白（占编码基因的 40%）和细胞外分泌蛋白并不适用于现有的 TPD 方法。

2020 年，Bertozzi 等人报道了溶酶体靶向嵌合体（LYTACs），这是一种实现膜蛋白降解的重要方法。LYTACs 通过聚糖 - 抗体生物偶联，将细胞膜上的目标蛋白（POI）与溶酶体穿梭蛋白，如甘露糖 - 6 - 磷酸受体（M6PR）连接起来。然而，当前基于抗体的 LYTACs 存在合成困难、肿瘤穿透能力差等缺点。因此，人们提出了几种有意义的策略，包括组织特异性的 GalNAc - LYTACs、细胞因子介导的 KineTACs、基于细胞穿透肽 / 溶酶体分选序列的共价 GlueTACs 以及基于寡核苷酸的 Apt - TACs。与抗体、融合蛋白和适体 TPD 技术相比，基于小肽的 TPD 更为直接、成本效益更高，且具有更好的肿瘤穿透能力。

另一方面，溶酶体内吞受体，如去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）和 M6PR，容易被内源性配体占据，从而影响目标蛋白的降解。此外，尽管通过破坏 retromer 复合物可以提高这些 LYTACs 的有限效率，但只有极少部分受体能够循环回到质膜，导致无法实现对目标蛋白的持久降解。为了克服这些挑战，关键在于为 TPD 技术确定更优的靶点。转铁蛋白受体 TFRC 对细胞铁摄取至关重要，是具有高循环效率的受体之一。TFRC 在肿瘤细胞上过表达，并且无论周围配体的丰度如何，其表达都相对稳定，这使其成为实现膜蛋白高效、持久降解的理想靶点。Guangjun Nie 等人最近开发了一种基于 TFRC 的 LYTAC，将基因编码的 TFRC 靶向肽与 PD - L1 抗体融合。然而，基于 L - 肽的 TFRC - LYTAC 半衰期有限，结合效果欠佳，严重阻碍了其降解目标蛋白的功效。此外，该肽与 TFRC 的结合稳定性差，只能导致蛋白的短暂降解。

为了提高肽在体内的稳定性，避免被蛋白水解酶快速清除，共价标记技术已被证明是一种有效的策略。随着下一代点击化学硫（VI）氟交换（SuFEx）反应的发展，能够靶向多种亲核残基（包括赖氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）和组氨酸（His））的芳基磺酰氟基团（ASFs）因其高稳定性和高反应速率而备受关注。因此，研究人员提出，利用共价修饰的 ASF 肽作为 TPD 平台，将大大提高肽对目标蛋白的结合能力和降解效率。遗憾的是，ASF 缺乏灵活的长侧链，且长度与经典氨基酸相似，限制了其交联更远目标残基的反应半径。因此，设计带有灵活长侧链的 ASF 衍生物，可能是显著提高肽的结合持久性和稳定性的便捷途径。

在此，研究人员开发了一种模块化的基于共价肽的溶酶体靶向降解平台（命名为 Pep - TACs），以促进目标蛋白的有效降解。具有结构稳定性和高亲和力的 TFRC 特异性靶向 D - 构型肽 DT7，其占据与转铁蛋白不同的结合口袋，将其与靶向目标蛋白的共价肽连接，形成嵌合肽，即 Pep - TACs。作为概念验证，研究人员选择了介导肿瘤免疫逃逸的关键免疫检查点 PD - L1，来展示 Pep - TACs 降解平台的效用。研究人员设计并引入了一种具有 SuFEx 反应特性的柔性非天然氨基酸 k - ASF，以提高对目标蛋白的结合稳定性，显著增强其转运至溶酶体的可能性。这种便捷的 Pep - TACs 平台将为高效膜蛋白降解工具的开发提供思路。

二、结果

2.1 TFRC 是 TPD 设计的理想靶点

为了扩充有限的用于 TPD 的溶酶体穿梭受体库，研究人员利用癌症基因组图谱（TCGA）的数据，检测并比较了多种溶酶体靶向受体（LTRs），包括甘露糖 - 6 - 磷酸受体（M6PR）、去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）、低密度脂蛋白受体（LDLR）、转铁蛋白受体（TFRC）、整合素 αV（ITGAV）、叶酸受体 1（FOLR1）和表皮生长因子受体（EGFR）在结肠癌、黑色素瘤、胶质瘤和乳腺癌中的表达谱。结果表明，在上述肿瘤中，TFRC 的表达水平通常高于其他 LTRs（补充图 1a）。此外，与其他 LTRs 相比，如 LDLR 和 EGFR，其表达易受周围环境中配体的影响，以及 FOLR1 和 EGFR 在内吞后会被降解，TFRC 因其环境稳定性、受体可循环性以及在多种肿瘤中的高表达而脱颖而出（补充图 1b）。随后，在细胞水平对 TFRC 的评估显示，其在人和小鼠肿瘤细胞中均有强表达（补充图 1c）。因此，TFRC 是 TPD 平台设计的理想靶点。

2.2 基于 TFRC 的 Pep - TAC 能与目标蛋白紧密结合并诱导内吞作用

作为概念验证，研究人员通过不同长度的接头将 TFRC 靶向肽 DT7 和 PD - L1 靶向肽 OPBP1 (8 - 12) 连接，设计了一系列作为 Pep - TACs 的嵌合肽（补充图 2a）。没有接头的 Pep - 1 能够与 TFRC 和 PD - L1 显著结合，而任何形式的接头都会显著降低结合亲和力（补充图 2b、c）。此外，共聚焦成像显示，与 DT7 和无关肽 GA 相比，Pep - 1 能被 TFRC 过表达的肿瘤细胞显著内吞（补充图 2d）。出乎意料的是，与对照肽 GA 相比，Pep - 1 对 B16 细胞表面膜 PD - L1 的降解作用仅略有降低（补充图 2e）。这可能归因于短肽的结合稳定性有限，导致其驻留时间不足以促进 PD - L1 转运至溶酶体。因此，有必要进一步优化嵌合肽，以提高目标降解效率。

2.3 共价 Pep - TAC 能显著降解 PD - L1

为了解决上述难题，研究人员引入了一类用于点击化学硫（VI）氟交换（SuFEx）反应的芳基磺酰氟基团（ASF），其能够以高稳定性和高反应速率靶向多种亲核残基（包括 Lys、Tyr、His），以克服因亲和力低导致的脱靶问题。考虑到 ASF 缺乏灵活的长侧链，且长度与天然氨基酸相似，限制了其交联远处目标残基的能力，研究人员引入了具有长而灵活侧链的 D - 赖氨酸（k）来修饰 ASF，得到 k - ASF（命名为 x）（图 1a，补充图 3a、b）。最初检测了 ASF 和 k - ASF 在 SuFEx 反应中的反应速率，结果显示 k - ASF 的反应速率比 ASF 快 2.5 倍（图 1b）。通过用 k - ASF 替换肽 OPBP1 (8 - 12) 上的氨基酸，合成了一系列能够与 PD - L1 共价结合的共价 Pep - TACs，并分别命名为 f12x、s11x、y10x 和 v9x。与非共价 Pep - 1 相比，这些共价 Pep - TACs 在 2 小时和 24 小时时，均能显著降低 B16 和 MC38 细胞表面 PD - L1 的表达。在 6 小时时观察到 PD - L1 表达略有增加，这可能是由于 TFRC 的内体循环。然而，用肽处理 48 小时后，PD - L1 的降解仍然显著，其中 s11x 和 v9x 的效果更为明显（图 1d、e，补充图 3c）。值得注意的是，s11x 和 v9x 能够诱导细胞内 PD - L1 整体蛋白水平下降，降解率分别高达 76% 和 91%（图 1f）。这些结果表明，Pep - TAC 的共价修饰大大增加了其与 PD - L1 的共价亲和力，这可以解释大量 PD - L1 被转运至溶酶体的现象（图 1e）。随后，合成了生物素标记的共价 Pep - TAC v9x，以验证这一假设。蛋白质免疫印迹（WB）分析显示，生物素 - v9x 而非生物素 - Pep - 1 能够与 PD - L1 共价结合（图 1g）。此外，蛋白质质谱法证实了 v9x 与人源和鼠源 PD - L1 的共价结合（图 1h）。

2.4 TFRC 介导的内吞作用是共价 Pep - TAC 的主要作用机制

为了证实共价 Pep - TACs 对靶点的结合亲和力增强，研究人员在 pH7.4 条件下，测试了 Pep - TACs 在 PD - L1 - Fc 蛋白与 CHOK1 - PD - 1 细胞之间的阻断效果，检测时间为 2 小时和 6 小时。结果表明，v9x 能够以 80% - 90% 的比例阻断 PD - 1/PD - L1 相互作用，这一比例显著高于 PD - L1 阻断肽 OPBP1 (8 - 12)、k - ASF 修饰的 PD - L1 靶向肽（称为 OPBP1 (8 - 12) - v2x）以及非共价 Pep - 1。此外，与 OPBP1 (8 - 12) - v2x 相比，Pep - 1 和 v9x 对 PD - 1/PD - L1 的阻断作用更有效，这可能归因于与肽 DT7 偶联后，嵌合肽的构象更加稳定（补充图 3d）。然后，采用微尺度热泳（MST）法测定 Pep - TAC 与 PD - L1 和 TFRC 的结合亲和力。非共价 Pep - 1 和 v9x 均能与人源和鼠源 TFRC 以及 PD - L1 结合。与 Pep - 1 相比，v9x 对 PD - L1 的结合亲和力更高，提高了约 2 倍（补充图 3e）。综上所述，这些结果表明，共价 v9x 能够显著结合 PD - L1 并阻断 PD - 1/PD - L1 相互作用。进一步，研究人员在 TFRC 敲低的 B16 细胞中探索了 v9x 的内化机制，通过 qPCR 在 mRNA 水平和流式细胞术在蛋白质水平验证了 TFRC 的表达，且 PD - L1 的内在表达未受影响。在 B16 细胞中，生物素 - v9x 比生物素 - Pep - 1 显著内化，且 PD - L1 显著降解，而在 TFRC 敲低的 B16 细胞中，Pep - TACs 的内化和 PD - L1 的降解均显著受损，表明其为 TFRC 依赖性内吞作用（图 2a）。

TFRC 是频繁循环回到细胞膜的内吞受体之一，TFRC - Pep - TAC - PD - L1 三元复合物可能会被 TFRC 部分回收并循环回到细胞表面。为了追踪该复合物，研究人员用溶酶体标记物 Lamp1 和循环内体标记物 Rab11 对细胞进行标记。v9x 孵育 2 小时后，PD - L1 与 Lamp1 强烈共定位，但不与 Rab11 共定位；4 小时时，PD - L1 与 Lamp1 和 Rab11 均共定位；6 小时时，PD - L1 仅与 Rab11 共定位（图 2b 和补充图 4c）。这些发现表明，TFRC 介导的 PD - L1 内循环降解过程能够导致 PD - L1 的持续降解。同时，为了证实共价 Pep - TACs 仍然能够结合循环回到细胞表面的 PD - L1，研究人员测量了在与 Pep - TACs 孵育 48 小时后，PD - 1 - Fc 蛋白与表达鼠源 PD - L1 的 293T、B16 和 MC38 细胞的结合情况。正如预期的那样，共价 Pep - TACs 仍然能够阻断 PD - 1/PD - L1 相互作用，阻断率高达 40%（图 2c）。这意味着共价 Pep - TACs 不仅能够降解 PD - L1，而且在 PD - L1 循环回到细胞表面时，还能够阻断 PD - 1/PD - L1 相互作用。

2.5 共价 Pep - TAC 在肿瘤微环境中显著诱导 PD - L1 溶酶体降解

在 pH7.4 条件下，共价 v9x 能够显著降解 B16 和 MC38 细胞中的 PD - L1，且这种降解可被溶酶体抑制剂磷酸氯喹（CQ）逆转，但不受蛋白酶体抑制剂 MG132 的影响，表明 v9x 的靶向降解依赖于 TFRC 依赖性溶酶体降解（图 3a）。此外，v9x 主要发挥靶向阻断和降解作用，而不影响肿瘤细胞的增殖（补充图 5a）。尽管先前的研究表明，肽 DT7 比 T7 对蛋白水解降解具有显著的抗性，但研究人员还是测试了 Pep - 1 和 v9x 的稳定性，结果显示它们在人血清中 72 小时内是稳定的（补充图 5b）。

进一步，研究人员探索了共价 v9x 在由升高的干扰素 - γ（IFN - γ）水平模拟的复杂肿瘤微环境中的功能，已知 IFN - γ 可上调 PD - L1 的表达，且在酸性 pH 条件下进行研究。与先前的发现一致，IFN - γ 被发现能够增强 PD - L1 的表达。Pep - 1 和 v9x 均能显著降低 PD - L1 的表达，v9x 在有无 IFN - γ 刺激下的降解效力相似（图 3b）。鉴于肿瘤微环境（pH 约为 6.5 - 6.8）和内体中的溶酶体转运（pH 约为 5.2 - 6.8）均为酸性环境，研究人员还探索了 Pep - TACs 在酸性条件（pH6.0）下的功能。在 pH6.0 时，mPD - L1 和 mTFRC 在 mRNA 水平显著上调，但在细胞表面的蛋白质水平并未上调（补充图 5c）。在 pH6.0 时，v9x 仍然能够显著阻断人和鼠的 PD - 1/PD - L1 相互作用，6 小时时阻断率最高可达 93%，2 小时时半数抑制浓度（IC50）为 10μM（补充图 5d、e）。虽然 Pep - TAC 对 TFRC 的亲和力在 pH6.0 和 pH7.4 时保持一致，但其对 PD - L1 的亲和力在 pH6.0 时显著增加了 21 倍（补充图 5f）。这种增强的结合可能有助于在 pH6.0 时观察到比 pH7.4 时更强的 Pep - TACs 降解作用。更重要的是，Pep - TACs 在肿瘤细胞上对 PD - L1 的靶向降解在 pH6.0 时显著高于 pH7.4（图 3c 和补充图 5g）。综上所述，这些结果表明，Pep - TACs 可能通过降解和阻断 PD - L1 在肿瘤中发挥强大的免疫反应。

在肿瘤微环境中，存在大量的树突状细胞和巨噬细胞，研究表明这些细胞上的 PD - L1 表达发挥着关键的免疫抑制作用。PD - L1 和 TFRC 在原代细胞（骨髓来源的树突状细胞（BMDC）和骨髓来源的巨噬细胞（BMDM））和细胞系（DC2.4 和 RAW264.7）的表面均有表达（补充图 6a）。在 pH6.0 条件下，通过蛋白质免疫印迹检测，共价 v9x 在 DC2.4 细胞中的降解效率提高了约 18%，在 RAW264.7 细胞中提高了约 50%（图 3d、e），并通过流式细胞术检测了 pH7.4 和 pH6.0 时 PD - L1 和 TFRC 的表面表达（图 3d、e，补充图 6b）。与在肿瘤细胞中的发现一致，酸性条件显著提高了 mPD - L1 和 mTFRC 的 mRNA 水平，但通过流式细胞术检测发现，其对蛋白质水平没有影响（补充图 6c、d）。此外，共价