视觉皮层外侧丘脑后核回路调节雄性小鼠的抑郁样行为

　　

雄性小鼠中视觉皮层 - 丘脑后外侧核回路调节抑郁样行为

抑郁症是一种普遍存在的精神疾病，病因不明且具有高度异质性。近期研究发现，抑郁症与初级视觉皮层（V1）存在关联。然而，V1 影响抑郁样行为的精确神经回路仍未完全明晰。在此项研究中，来自南京中医药大学药学院的研究人员证实，在慢性束缚应激（CRS）后，雄性小鼠的 V1，尤其是投射到丘脑后外侧核（LP）的 V1 谷氨酸能亚群（神经元）活动会减少，进而引发抑郁样行为。通过光遗传学或化学遗传学激活这些神经元，能够改善 CRS 诱导的抑郁小鼠的抑郁样行为，而降低其活动则会加剧这些行为。神经元活动的减少主要是由于鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基 γ - 4（Gγ4）的下降。在神经元中过表达 Gγ4 会产生抗抑郁样效果，这表明 Gγ4 是情绪的关键调节因子。总体而言，这些结果揭示了一个调节抑郁样行为的 V1→LP 回路，为治疗干预提供了潜在靶点。

重度抑郁症（MDD）是一种常见且高度异质的精神疾病，在全球人类疾病负担中排名第二。Papez 回路的损伤与 MDD 等情绪障碍密切相关，涉及下丘脑、海马体、前丘脑核、扣带回和内嗅皮层等核心区域的损伤。随着光遗传学和多模态神经成像技术的发展与应用，其他与情绪相关的区域也被确定，包括前额叶皮层、外侧缰核、伏隔核和杏仁核。重要的是，通过磁共振成像（MRI）检测到的情绪处理、奖赏寻求和情绪调节功能障碍，已被纳入《精神疾病诊断与统计手册》（DSM - 5）中，作为 MDD 的辅助诊断依据。

近年来，越来越多的证据表明，枕叶视觉皮层（一个传统上不被认为与情绪相关的脑区）与抑郁障碍之间存在联系。神经影像学研究显示，抑郁症可能导致视觉皮层结构异常、视觉运动抑制失调、视觉网络及其与注意力和听觉网络的功能连接异常，以及枕叶脑血流量或葡萄糖代谢减少。已确定氯胺酮具有快速强效抗抑郁作用的机制之一，是增强 MDD 患者视觉皮层的 γ 振荡。初级视觉皮层（V1）投射到丘脑枕和上丘，它们通过杏仁核和纹状体调节情绪行为。值得注意的是，小鼠的丘脑后外侧核（LP）被认为与灵长类动物的丘脑枕功能相似。此外，临床研究一直观察到 MDD 患者丘脑的结构和功能异常。

在先前的研究中，研究人员发现视觉皮层（包括 V1）是重复经颅磁刺激（rTMS）治疗 MDD 患者的有效靶点。随后的动物研究表明，对慢性应激导致的抑郁敏感小鼠的 V1 区域进行精确磁刺激，可迅速缓解抑郁症状，这种效果与 V1 区域神经元激活中突触可塑性缺陷的逆转有关，源于磁电效应。然而，视觉皮层及其投射和神经回路在抑郁症发病中的具体机制仍有待深入探索。

在本研究中，研究人员采用慢性束缚应激（CRS）程序诱导小鼠产生抑郁样行为。研究证实，CRS 暴露导致 V1 神经元活动减少，而化学遗传学和光遗传学激活这些神经元可逆转 CRS 诱导的抑郁样行为。CRS 主要导致 V1 谷氨酸能神经元活动下调，且 V1 - LP 神经支配在调节抑郁样行为中起着至关重要的作用。在亚阈值应激条件下抑制投射到 LP 的 V1 谷氨酸能（）神经元，最初会诱导抑郁样行为，并加剧 CRS 程序导致的抑郁表型。相反，增强这些神经元的活动可显著改善抑郁样行为。最后，研究人员发现 V1 谷氨酸能神经元活动低下的行为效应，很大程度上可归因于这些神经元内鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基 γ - 4（Gγ4）的减少。总的来说，这些发现凸显了 V1 谷氨酸能回路在应对慢性应激和调节随后的抑郁样状态中的重要且多方面的作用。

结果

慢性应激导致抑郁样小鼠 V1 区神经元活动减少

为了研究慢性应激对 V1 区神经元活动的影响，研究人员使用 CRS 方案（连续 21 天束缚应激，每天 2 小时）建立了小鼠抑郁模型。为排除单一应激源的即时效应，研究人员还比较了接受急性束缚应激（ARS，第 21 天 2 小时）的小鼠（图 1a）。对所有组进行了行为测试，包括蔗糖偏好测试（SPT）、旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST）。与对照组小鼠相比，ARS 小鼠未表现出抑郁样行为。然而，CRS 组小鼠在 SPT 中蔗糖摄入偏好降低，在 FST 中不动时间增加，但在 OFT 中的运动距离没有显著变化（图 1b - e）。随后，研究人员探究 CRS 是否会影响应激小鼠 V1 区的神经元活动。与对照组相比，CRS 小鼠 V1 区 c - Fos + 细胞数量显著减少，而 ARS 小鼠未观察到这种变化。有趣的是，这种减少主要发生在 CRS 小鼠 V1 区的第 5 层和第 6 层（图 1f，g）。此外，V1 区 c - Fos + 细胞数量与抑郁样行为的严重程度呈显著负相关，这在 SPT 中的蔗糖偏好和 FST 中的不动持续时间中得到体现（图 1h，i）。同样，在经过 6 周慢性不可预测轻度应激（CUMS）范式处理的抑郁样小鼠中，V1 区 c - Fos + 细胞数量也减少了（补充图 1）。这些结果初步证明，慢性应激会导致表现出抑郁样行为的小鼠 V1 区神经元活动减少。

激活 V1 神经元产生抗抑郁样效果

接下来，研究人员探索激活 V1 神经元是否能逆转 CRS 小鼠的抑郁样行为。研究人员使用化学遗传学方法，将 hM3D（Gq）腺相关病毒（AAV）（一种仅由设计药物激活的设计受体）双侧注入 C57 小鼠的 V1 区（图 2a，补充图 2a）。成像数据证实，hM3D（Gq）病毒感染的神经元局限于 V1 区（图 2b）。研究人员发现，腹腔注射（i.p.）氯氮平 - N - 氧化物（CNO，一种 hM3D（Gq）激动剂）与注射生理盐水相比，显著增加了 V1 神经元的活动（图 2c，d）。为探究化学遗传学激活 V1 神经元的抗抑郁样效果，研究人员进行了 CRS 模型实验（图 2e，补充图 2b）。结果表明，在注射 hM3D（Gq）病毒的小鼠中，单次注射 CNO 在第 1 天显著减少了 FST 中的不动时间，并增加了 SPT 中的蔗糖摄入量，但在注射后第 3 天和第 7 天无效（补充图 2c，d）。值得注意的是，三次注射 CNO 产生了更显著和更持久的抗抑郁样效果（图 2f，g 和补充图 2e，f）。

随后，研究人员使用光遗传学方法证实了这些结果（图 2h，i 和补充图 3a，b）。470nm 光刺激（蓝色条）可在感染的 V1 神经元中诱发动作电位（图 2j）。虽然 1Hz 蓝光对 FST（补充图 3c）或 SPT（补充图 3d）结果没有影响，但 5Hz 蓝光显著减少了未处理小鼠 FST 中的不动时间（补充图 3e），但对 SPT 没有影响（补充图 3f）。因此，使用 5Hz 470nm 蓝光对接受 CRS 处理的小鼠（图 2k）进行光遗传学激活 V1 神经元，减轻了 FST 中的绝望感（图 2l）和 SPT 中的快感缺失（图 2m）。重复光遗传学激活也产生了更持久的抗抑郁样效果（补充图 3g - j），这表明 CRS 诱导的抑郁样行为是由于 V1 神经元活动减少所致。

V1 谷氨酸能神经元介导抑郁样行为

为了研究 CRS 小鼠 V1 区活动减少的神经元类型，研究人员用兴奋性神经元标记物钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIα（CaMKIIα）、抑制性神经元标记物谷氨酸脱羧酶 67（GAD67）和 c - Fos 对脑切片进行共染色。如图 3a，b 所示，CRS 小鼠 V1 区激活的 CaMKIIα + 神经元数量显著减少。相反，CRS 组激活的 GAD67 + 神经元数量增加（补充图 4a，b），这表明 CRS 暴露显著降低了 V1 区兴奋性神经元的活动。

接下来，研究人员采用体内荧光光度法记录 V1 兴奋性神经元的自发钙活动（图 3c，补充图 5a）。在 5 分钟束缚期之前（基线）、期间和之后（后期）记录 V1 CaMKIIα + 神经元的群体钙反应（补充图 5b）。如补充图 5c，d 所示，未处理小鼠在束缚期间 V1 区的自发钙信号减少。研究人员比较了 1 天 ARS 和 21 天 CRS 范式后神经元的钙反应。如图 3d，e 所示，CRS 组小鼠 V1 区的自发钙信号（幅度和频率）显著降低。总体而言，这些结果表明 V1 谷氨酸能神经元活动减少与抑郁情绪状态之间存在关联。

研究人员随后检查了 V1 谷氨酸能神经元活动低下是否导致了观察到的抑郁样行为。通过切片记录，研究人员证实表达 hM4D（Gi）的 CaMKIIα 神经元可被配体 CNO 抑制（补充图 6a - c）。将 CaMKIIα - hM4D（Gi）AAV 载体注射到小鼠 V1 区，随后给予三次 CNO 注射（图 3f，g）。化学遗传学抑制 V1 区的群体，导致 FST 中的不动时间增加（图 3h）和 SPT 中的蔗糖偏好降低（图 3i）。值得注意的是，在 CaMKIIα - mCherry 对照组中，给予 CNO 没有效果（补充图 6d - g）。这些结果表明，急性减弱 V1 谷氨酸能神经元的活动足以诱导抑郁样行为。

此外，研究人员证实了化学遗传学激活 V1 兴奋性神经元的行为效应（图 3j，补充图 7）。如图 3k - m 所示，增强 V1 谷氨酸能神经元的活动减轻了 CRS 范式后的抑郁样行为（图 3l，m）。综上所述，这些结果支持了 V1 谷氨酸能活动减少与 CRS 处理小鼠的抑郁样行为之间存在因果关系。

光遗传学激活 V1 - LP 谷氨酸能通路改善抑郁样行为

为了研究 CRS 诱导的抑郁样行为的神经回路，研究人员探索了 V1 神经元投射的下游区域。通过将编码 CaMKIIα 启动子 EGFP 的 AAV 注射到 C57 小鼠的 V1 区，研究人员观察到大量荧光标记的轴突投射，这些投射主要位于丘脑后外侧核（LP）、丘脑外侧背核（LD）和上丘（SC）（图 4a，b）。研究人员随后在成年 Ai14 小鼠（一种 tdTomato Cre 报告系）中采用跨神经元顺行追踪来证实这些结果（补充图 8a，b）。如补充图 8c - e 所示，LP、LD 和 SC 区域有大量荧光标记的细胞体。共定位分析显示，大多数接受 V1 投射的 LP 神经元与 CaMKIIα 共标记（补充图 8f，g），并且这些神经元的活动在 CRS 诱导的抑郁小鼠中降低（补充图 8h，i）。

因此，研究人员通过光遗传学激活未处理小鼠这些区域的 V1 谷氨酸能轴突，来研究这三个主要的 V1 谷氨酸能投射在抑郁样症状中的作用（图 4c - e，补充图 9a - c）。激活 V1 到 LP 的谷氨酸能投射减少了 FST 中的不动时间，但对蔗糖偏好没有影响（图 4f，g）。激活到 SC 或 LD 的投射对 FST 中的不动持续时间没有影响（补充图 9d）。随后，研究人员检查了激活 V1 到 LP 的谷氨酸能投射对 CRS 范式后抑郁样行为的影响（图 4h）。激活 V1到 LP 的投射减轻了 CRS 抑郁小鼠的绝望感和快感缺失（图 4i，j）。这些发现表明，V1 到 LP 的谷氨酸能投射可能介导抑郁样表型，而到 LD 或 SC 的投射可能没有作用。

为了研究 V1 - LP 投射的功能作用，研究人员将单突触逆行病毒 AAV2 / Retro - Cre 注入 LP，并将编码 EYFP 的 Cre 依赖病毒（AAV2 / 9 - EF1α - DIO - EYFP）注入 C57 小鼠的 V1 区（图 4k）。四周后，处死小鼠并观察 V1 区中 EYFP 标记的神经元（图 4l）。研究人员使用电生理记录评估 V1 - LP 投射刺激对 LP 神经元活动的影响（图 4m）。光遗传学激活 ChR2 阳性终末导致 LP 神经元中电流诱发动作电位的频率增加（图 4n，o）。接下来，研究人员记录 LP 神经元中的光诱发突触后电流。在一些 LP 神经元中观察到蓝光诱发的兴奋性突触后电流（eEPSCs），这些电流可被 α - 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸（AMPA）/ 红藻氨酸受体拮抗剂 6 - 氰基 - 7 - 硝基喹喔啉 - 2，3 - 二酮（CNQX）阻断（图 4p）。在 LP 内，刺激 V1 终末可诱发单突触反应（在存在河豚毒素和 4 - 氨基吡啶以抑制多突触反应的情况下；图 4q）。总体而言，这些结果表明 V1 神经元主要通过单突触谷氨酸能突触支配某些 LP 神经元。

V1 谷氨酸能神经元中 Gγ4 的下调加剧抑郁样行为，降低兴奋性并增强抑制性传递

为了更深入地了解慢性应激降低 V1 神经元活动以诱导抑郁样行为的分子机制，研究人员对应激小鼠和对照小鼠的 V1 组织进行了基于等量异位标签相对和绝对定量（iTRAQ）的相对定量蛋白质组学分析（蛋白质组交换联盟，PRIDE：PXD031598）。共鉴定出 104 种差异表达蛋白（DEPs）（基于 P 值 <0.05 和 log2 倍数变化> 0.2 的阈值，其中 50 种上调，54 种下调）（补充图 10a）。对前 50 种 DEPs 的层次聚类分析表明，三个生物学重复样本聚为一组（补充图 10b）。这 104 种 DEPs 在功能上被分为 25 个注释簇（补充图 10c）。

激活神经元减轻抑郁样行为

为了验证它们的差异表达，研究人员选择了与 DEPs 对应的 35 个基因进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）分析（补充表 1）。与对照组相比，CRS 组小鼠 V1 区鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G 蛋白）亚基 γ - 4 基因（Gng4）的表达显著降低（补充图 11a，b）。此外，在 CRS 小鼠的 V1 区检测到 Gγ4 蛋白水平降低（图 6a，b），并且 V1 区的 Gγ4 水平与抑郁样行为的严重程度呈显著负相关，Gγ4 水平较高的小鼠在 FST 中的不动时间较短，在 SPT 中的蔗糖偏好增加（图 6c，d）。随后，研究人员使用免疫荧光检查小鼠 V1 神经元中 Gγ4 的表达模式。如图 6e，f 和补充图 11c 所示，检测到 Gγ4 和 CaMKIIα 之间存在强烈的共表达。约 79.54% 的 Gγ4 标记细胞与 CaMKIIα 共标记（图 6f），这表明 V1 区的细胞主要是谷氨酸能的。进一步的实验证实了 CRS 小鼠 V1 兴奋性神经元中 Gγ4 水平降低（图 6g，h），而在抑制性神经元中未观察到明显变化（补充图 11d，e）。这些发现表明，CRS 暴露显著降低了 V1 谷氨酸能神经元中 Gγ4 的表达。

研究人员研究了慢性应激后神经元活动的变化。为了标记神经元，分别将 AAV2 / Retro - CaMKIIα - Cre 和 AAV2 / 9 - DIO - mCherry AAV 载体注入 LP 和 V1 区（图 5a）。如图 5b 和 c 所示，CRS 抑郁样小鼠 V1 区中激活的 mCherry + 神经元百分比显著降低。接下来，研究人员进一步研究了神经元对抑郁样行为的影响。为此，分别将 AAV2 / Retro - CaMKIIα - Cre 和 AAV2 / 8 - DIO - hM3D（Gq） - mCherry AAV 载体双侧注入 LP 和 V1 区（图 5d）。激活神经元减少了未处理小鼠 FST 中的不动时间，但对蔗糖偏好没有影响（图 5e - g）。长时间暴露于 CRS 显著加剧了抑郁样行为；相反，对接受 CRS 处理的小鼠（图 5h）进行化学遗传学激活神经元，减少了不动时间（图 5i）并增强了蔗糖偏好（图 5j）。研究人员还检查了抑制这些神经元的影响。分别将 AAV2 / Retro - CaMKIIα - Cre 和 AAV2 / 9 - DIO - hM4D（Gi） - mCherry AAV 载体双侧注入 LP 和 V1 区（图 5k）。抑制未处理小鼠中的神经元增加了 FST 中的不动时间（图 5l，m）并降低了蔗糖偏好（图 5n）。在亚阈值 CRS（SCRS）模型中，抑制神经元促进了抑郁样行为（图 5o - q）。在使用 CRS 程序诱导抑郁样小鼠后，抑制 $Glu1+LP