在细胞迁移研究领域，细胞通常被认为会依据细胞类型和环境因素，采用机制各异的迁移模式。这些迁移模式一般被假定由相互排斥的肌动蛋白细胞骨架组织驱动，即片状（扁平、分支状网络）或皮质（与质膜交联）的肌动蛋白组织形式。来自伦敦国王学院兰德尔细胞与分子生物物理学中心（第一作者单位）的研究人员，通过对果蝇巨噬细胞（血细胞）发育扩散过程的研究，揭示了这些细胞在细胞前端维持片状肌动蛋白网络，同时在后端保持皮质肌动蛋白网络。经典肌动蛋白皮质调节因子（如 Moesin）的缺失，会扰乱血细胞的形态和细胞迁移过程。此外，皮质和片状伪足肌动蛋白网络之间存在相互调节作用。当 Moesin 发生磷酸化并与质膜结合后，会被片状肌动蛋白流带到细胞后端。与此同时，皮质肌动蛋白网络会反馈作用于片状肌动蛋白，协助调节肌动蛋白流的速度和前沿动态。这些数据表明，血细胞的运动性需要片状伪足和皮质肌动蛋白结构处于稳态平衡。
细胞迁移被认为涉及具有独特肌动蛋白网络结构的不同运动模式。间充质迁移模式需要细胞与底物紧密黏附，在前沿形成扁平、分支状的肌动蛋白突起（即片状伪足）。相反，变形虫样运动则要求细胞与底物的附着较弱，且细胞周围的皮质肌动蛋白 - 肌球蛋白收缩力较强，从而导致静水压力增加，驱动细胞前端形成基于泡状突起的延伸。这些迁移模式也被认为涉及不同的调节机制。Ezrin、Radixin、Moesin（ERM）家族成员负责控制皮质肌动蛋白与膜的交联，对于一些被认为进行变形虫样迁移的细胞类型（如斑马鱼生殖细胞、T 细胞和中性粒细胞）的迁移至关重要。然而近年来，这些原本被认为不同迁移模式的特征开始变得模糊。在被认为进行变形虫样运动的细胞中可观察到扁平的片状结构，反之，在进行间充质迁移的细胞中也存在泡状突起。此外，ERM 蛋白及其在皮质的局部缺失，能够驱动进行间充质迁移的细胞产生片状伪足突起，并控制细胞迁移的方向性。数据还显示，无论迁移模式如何，许多细胞类型都具有朝向细胞后端极化的独特皮质肌动蛋白网络，同时在前端含有片状伪足。因此，迁移细胞中可能同时存在片状和皮质肌动蛋白网络的相反梯度，理解它们如何协调以控制细胞运动性至关重要。
果蝇胚胎巨噬细胞（血细胞）在胚胎中扩散，其前沿具有宽阔扁平的片状伪足。此前，第一作者单位的研究人员利用在血细胞扩散过程中对片状肌动蛋白流进行活体成像的技术，揭示了它们的运动由片状网络中从前端到后端高度协调的肌动蛋白逆向流动驱动。在本研究中，研究人员进一步发现这种肌动蛋白流会转变为与膜相关的皮质肌动蛋白结构，这表明片状和皮质肌动蛋白网络必须协同调节，以控制血细胞的迁移。
研究结果
- 血细胞在发育扩散过程中同时维持片状伪足和皮质肌动蛋白网络：对血细胞迁移进行活体成像，结果显示肌动蛋白从片状伪足的前沿持续且协调地逆向流动。通过对该流场的负散度分析（负散度能够突出肌动蛋白网络中的汇聚区域，即肌动蛋白丝发生收缩和解聚的区域），结合变形映射，研究人员发现片状伪足后端存在一个区域，在该区域肌动蛋白网络突然受到压缩（图 1a - c，补充视频 1）。这个肌动蛋白压缩区域紧邻血细胞的细胞体，细胞体周围有密集的肌动蛋白丝网络（图 1b，补充视频 2）。这种肌动蛋白的转变与血细胞形态的变化相关；片状伪足是扁平的二维结构，而细胞体更接近球形（图 1d，补充视频 3）。有趣的是，肌动蛋白压缩增加的区域与经典的肌动蛋白皮质相关成分（如 Moesin 和磷脂酰肌醇 4,5 - 二磷酸（PI ）的积累相关，这表明存在一个独特的皮质肌动蛋白网络，可能是由于质膜周围皮质张力的增加，导致了细胞形态向球形的改变（图 1e，补充视频 4）。因此，研究人员为果蝇适配了一种膜近端 F - 肌动蛋白探针（MPAct），该探针先前已用于在体外标记哺乳动物细胞中不同的皮质肌动蛋白网络。简而言之，研究人员构建了荧光标记的转基因，其表达含有膜靶向序列的肌动蛋白结合结构域（MPAct），同时构建了仅包含膜或肌动蛋白结合蛋白的对照探针。当 MPAct 和对照探针在细胞中共表达时，通过比率分析能够揭示细胞中与质膜相关的独特肌动蛋白丝区域。在滤泡、肠道和唾液腺上皮细胞以及边界细胞（据报道这些细胞都具有由 Moesin 调节的顶端肌动蛋白皮质）中表达该探针，结果显示 MPAct 在顶端皮质富集，这表明 MPAct 探针确实能够识别细胞中不同的肌动蛋白网络（补充图 1）。在血细胞中表达该探针，也揭示了在围绕细胞体的片状伪足后端，紧邻质膜处存在一个独特的肌动蛋白网络，证实了肌动蛋白皮质的存在。这些结果表明，迁移的血细胞中同时存在片状和皮质肌动蛋白网络（图 1f，补充视频 5、6）。
- Moesin 对血细胞的正常形态和发育扩散至关重要：接下来，研究人员探究了在缺乏 Moesin 的情况下，血细胞形态是否会受到影响。携带果蝇 moesin 突变等位基因（果蝇中唯一的 ERM 家族成员）的胚胎，表现出肌动蛋白皮质富集减少，同时细胞体体积增大、细胞体球形度降低，而片状伪足大小不受影响（图 2a、b）。此外，细胞体周围肌动蛋白流场的负散度值增加，这表明肌动蛋白网络的压缩速率降低（图 2c、d）。最后，对 MPAct 探针的分析显示，moesin 突变的血细胞在细胞体周围的膜相关肌动蛋白网络减少，这与皮质肌动蛋白的减少一致（图 2e、f，补充视频 7）。随后，研究人员检测了 Moesin 受到干扰时血细胞的迁移能力。Moesin 突变的胚胎在血细胞发育扩散过程中出现缺陷，细胞速度和持续性降低（图 3a - c，补充视频 8）。此外，在缺乏 Moesin 的情况下，血细胞与相邻细胞碰撞时的排斥反应（接触抑制运动，CIL）也受到干扰（图 3d），这表明对皮质肌动蛋白网络的调节对于正常的 CIL 动态是必需的。通过巨噬细胞特异性表达 Moesin 的 RNA 干扰（RNAi），也复制出了胚胎扩散缺陷的表型，这表明这些 moesin 突变引起的迁移缺陷具有细胞自主性（图 3e - g）。Moesin 与肌动蛋白皮质的结合受磷酸化调节，在有丝分裂细胞变圆过程中负责激活 Moesin 的 sterile20 - 样激酶（slik）突变的胚胎，同样存在巨噬细胞扩散缺陷。此外，巨噬细胞特异性表达 slik 的 RNAi，也表现出与 moesin 突变体相似的表型（图 3e、g）。再者，已有研究表明 Moesin 在有丝分裂过程中的活性受 PI 结合的调节；参与 PI 生成的磷脂酰肌醇 4 - 磷酸 5 - 激酶（skittles，sktl）和磷脂酰肌醇 3 - 磷酸酶（Pten）突变的胚胎，其血细胞迁移缺陷与 Moesin 缺失的表型相似（图 3e - g）。这些数据表明，与 Moesin 在控制有丝分裂过程中细胞变圆的作用类似，Moesin 在迁移的血细胞中也参与控制肌动蛋白皮质的力学特性，这对于血细胞正常的细胞体形态和运动性至关重要。
- Moesin 的磷酸化和 PI 结合必须受到调节，以确保血细胞正常迁移：Moesin 的活性由其 C 末端肌动蛋白结合结构域中苏氨酸残基的磷酸化以及与质膜脂质 PI 的结合共同调控（图 4a）。因此，研究人员研究了一系列果蝇 moesin 转基因的活性，这些转基因包含全长野生型蛋白或在磷酸化和 PI 结合位点上存在突变。在野生型背景下，在血细胞中特异性表达单拷贝的这些 GFP 标记的转基因，未导致扩散出现严重缺陷（补充图 2）。然而，表达两个拷贝的某些转基因（即两个拷贝的 Gal4 和 UAS 转基因），会对血细胞胚胎扩散产生严重影响。两个拷贝的赖氨酸突变为天冬酰胺（K/N）突变（MoesinKN）会影响 Moesin 与 的结合能力，在一小部分胚胎中诱导血细胞扩散缺陷（图 3e、4c）。相比之下，两个拷贝的同时包含 K/N 突变和 T/A 突变（阻止 Moesin 磷酸化，MoesinTAKN）的转基因，导致更严重的扩散缺陷，这表明 PI 结合和 Moesin 磷酸化之间存在功能协同作用（图 3e、4c）。此外，两个拷贝的模拟磷酸化的 Moesin 突变体（T/D，MoesinTD，被认为具有组成型活性），导致大多数胚胎出现发育扩散缺陷，这表明 Moesin 的过度激活对细胞运动性极为不利（图 3e、4c）。有趣的是，在组成型活性的模拟磷酸化突变体（MoesinTDKN）中加入 PI 结合突变，能够挽救血细胞扩散缺陷（图 3e、4c）。这些数据表明，在迁移的血细胞中，Moesin 的磷酸化和 PI 结合对于其充分发挥活性都是必需的。随后，研究人员研究了 Moesin 过度激活对血细胞形态和皮质肌动蛋白网络的影响（图 4d、e）。虽然细胞体球形度未受影响，但与野生型 Moesin（MoesinWT）相比，MoesinTD 表现出细胞体体积增大，片状伪足体积减小，这表明血细胞胞体大小的增加是以片状伪足网络为代价的（图 4d、e）。此外，MoesinTD 导致细胞整体球形度增加，这可能是由于平面片状伪足的缺失（图 4d、e）。对使用 MPAct 的皮质肌动蛋白分析显示，虽然皮质肌动蛋白的总量没有整体变化，但 MoesinTD 导致皮质分布改变（图 4f - h，补充视频 9）。在野生型细胞中，皮质肌动蛋白从片状伪足的前端到后端呈梯度分布，在细胞体周围达到峰值（图 4f、h，补充视频 9）。然而，MoesinTD 导致 MPAct 梯度变平，这表明片状伪足区域内肌动蛋白网络与质膜的结合增强（图 4f、h，补充视频 9）。这些数据表明，片状伪足区域内过早形成的皮质肌动蛋白会抑制片状伪足的延伸，并改变片状和皮质肌动蛋白网络的平衡。与 MoesinTD 相比，MoesinTDKN 的膜结合能力降低，其血细胞迁移缺陷也相应减轻。Morphotrap internal 和 Morphotrap external 是一组果蝇转基因，分别将 GFP 标记的蛋白质招募到质膜的内表面或外表面。将 MoesinTDKN 招募到质膜外表面（Morphotrap external），与单独的 MoesinTDKN 一样，在血细胞发育扩散过程中未显示出缺陷（图 4c、6e、f）。然而，将其招募到质膜内表面（Morphotrap internal），则导致严重的迁移缺陷，模拟了 MoesinTD 的表型，这表明在血细胞运动过程中，激活的 Moesin 发挥功能需要与膜结合（图 4c、6e、f）。这些数据表明，肌动蛋白逆向流动对 Moesin 的有效运输需要 Moesin 与肌动蛋白结合并与膜结合，这促使 Moesin 被运输到片状伪足的后端，从而调节细胞体周围的皮质肌动蛋白网络。
- Moesin 的定位和肌动蛋白皮质的形成受片状肌动蛋白流的调节：随后，研究人员检测了 GFP 标记的 Moesin 突变转基因的定位，以了解 Moesin 的调节机制如何控制其在皮质的分布。在这种情况下，研究人员在野生型背景下表达单拷贝的这些转基因，因为这不会导致血细胞运动出现显著缺陷（补充图 2）。虽然大多数转基因在细胞体周围表现出一定程度的富集，但模拟磷酸化形式的 MoesinTD 导致皮质定位显著增加（图 5a、b，补充视频 10）。与之前揭示磷酸化和 PI 结合协同作用的数据一致，在模拟磷酸化形式的 Moesin（MoesinTD）中加入 K/N 突变（MoesinTDKN），降低了其在皮质的特异性定位（图 5a、b）。研究人员还观察到 Moesin 在片状伪足中的定位存在细微差异；MoesinTD 显示出从细胞体延伸到片状伪足的定位梯度，这表明它也在逐渐与片状肌动蛋白网络后端的肌动蛋白丝相互作用（图 5a、c，补充视频 10）。与这些数据一致，对肌动蛋白和 Moesin 构建体的活体成像显示，模拟磷酸化的 Moesin 以逆向方式流动，与其他 Moesin 突变转基因相比，其流动方向与肌动蛋白流的相关性最高（图 6a、b，补充视频 10）。在模拟磷酸化形式的 Moesin（MoesinTD）中加入 K/N 突变（MoesinTDKN），降低了 Moesin 在片状伪足中的梯度分布，并减少了其与肌动蛋白逆向流动的相关性（图 5c、6b）。这些数据表明，Moesin 磷酸化和 PI 结合之间的协同相互作用，使得 Moesin 被流动的肌动蛋白网络运输到血细胞片状伪足的后端。先前对迁移细胞的研究表明，任何具有足够肌动蛋白结合能力的蛋白质，都容易被肌动蛋白逆向流动运输，从而在片状肌动蛋白网络后端形成梯度分布。因此，研究人员通过荧光漂白恢复（FRAP）技术分析 Moesin 转基因的动力学，以检测扩散的变化，这可能暗示肌动蛋白结合效率的改变。FRAP 分析显示，与其他突变转基因相比，MoesinTD 在片状伪足中的半衰期增加（图 6c、d）。在 MoesinTD 中加入 K/N 突变（即 MoesinTDKN），增加了其扩散率，这表明 PI 结合对于充分降低激活的 Moesin 的扩散也是必需的（图 6c、d）。这些数据表明，磷酸化和 结合的共同作用，通过增强肌动蛋白结合和 / 或增加与质膜的结合，降低了 Moesin 在片状肌动蛋白网络中的流动性。最近的研究表明，与质膜的结合增加可以增强肌动蛋白流对分子的运输作用。因此，研究人员研究了人为改变 MoesinTDKN 的膜结合能力对其功能的影响，MoesinTDKN 与 MoesinTD 相比，血细胞迁移缺陷减轻。Morphotrap internal 和 Morphotrap external 是一组果蝇转基因，分别将 GFP 标记的蛋白质招募到质膜的内表面或外表面。将 MoesinTDKN 招募到质膜外表面（Morphotrap external），与单独的 MoesinTDKN 一样，在血细胞发育扩散过程中未显示出缺陷（图 4c、6e、f）。然而，将其招募到质膜内表面（Morphotrap internal），则导致严重的迁移缺陷，模拟了 MoesinTD 的表型，这表明在血细胞运动过程中，激活的 Moesin 发挥功能需要与膜结合（图 4c、6e、f）。这些数据表明，肌动蛋白逆向流动对 Moesin 的有效运输需要 Moesin 与肌动蛋白结合并与膜结合，这促使 Moesin 被运输到片状伪足的后端，从而调节细胞体周围的皮质肌动蛋白网络。
- Moesin 的活性对于正常的片状肌动蛋白流和前沿动态是必需的：虽然这些数据揭示了 Moesin 在迁移血细胞的后端调节肌动蛋白皮质，但研究人员也想知道 Moesin 是否对片状肌动蛋白网络的活动在功能上也是必需的。对血细胞形态动力学的分析显示，在缺乏 Moesin 的情况下，血细胞的片状伪足极性降低（图 7a、b，补充视频 11）。此外，Moesin 的缺失导致前沿速度降低，这表明其与细胞前端的突起机制存在反馈作用（图 7c、d）。而且，与血细胞运动相关的前沿突起减少，这表明迁移效率降低，这可能解释了细胞持续性的改变（图 3c、7e、f）。Moesin 突变体以及两个拷贝的模拟磷酸化 Moesin 转基因，也显示出肌动蛋白逆向流动速度显著降低，这表明 Moesin 的活性必须精确调控，才能保证正常的片状肌动蛋白流动（图 7g - j）。由于肌球蛋白对于肌动蛋白逆向流动和皮质组织也很重要，研究人员确定 Moesin 是否可能调节肌球蛋白的活性或定位。然而，研究人员观察到 moesin 突变的血细胞中，肌球蛋白在皮质的富集没有变化（补充图 3a、b）。此外，活体成像显示，虽然活性 Moesin（MoesinTD）分布在大部分皮质区域，但肌球蛋白的分布更呈点状（补充图 3c）。最后，通过流线分析对肌动蛋白流组织的检查显示，肌球蛋白突变细胞的肌动蛋白流场比 moesin 突变的血细胞更加紊乱（补充图 3d），这表明肌球蛋白和 Moesin 在血细胞中具有不同的功能。这些数据表明，细胞后端的血细胞肌动蛋白皮质，或者片状伪足中 Moesin 活性的逐渐
