柴油中微生物污染的MALDI-TOF质谱对比分析

　　

柴油燃料微生物污染的 MALDI-TOF MS 比较分析研究解读

来自 Nicolaus Copernicus University in Torun（尼古拉斯?哥白尼大学）多个部门的研究人员，包括 Agnieszka Ludwiczak、Tomasz Zieliński 等，在Scientific Reports期刊上发表了题为 “Comparative analysis of microbial contamination in diesel fuels using MALDI-TOF MS” 的论文。该研究聚焦柴油燃料微生物污染问题，对于保障燃料质量、提升燃料系统安全性和效率意义重大。准确识别柴油燃料中的微生物污染物，能够有效预防燃料系统故障，减少环境污染，为能源和运输行业的稳定运行提供关键支持 。

一、研究背景

现代柴油发动机技术对燃料质量要求极高，燃料中的微小污染物都可能引发严重的运行问题并缩短发动机寿命。燃料污染物来源广泛，如炼油、运输和储存过程中产生的颗粒物，以及因温度波动导致燃料罐中水蒸气凝结而混入的水等。其中，水的存在会促使微生物生长，微生物在燃料中的滋生会引发诸多问题，像燃料降解、过滤器堵塞和腐蚀等。此外，微生物生长形成的生物膜会严重影响燃料质量和系统完整性，在长期储存时微生物的繁殖更为显著。燃料污染不仅会导致燃烧室内燃烧不完全，增加氮氧化物、一氧化碳和颗粒物等污染物排放，危害空气质量和公众健康，还会在发动机部件上形成积碳，加剧燃烧问题，影响发动机长期性能 。

目前，检测液体燃料微生物污染水平的方法众多。ATP 测试能快速测定燃料样本中的整体生物活性，但无法在早期检测微生物污染物，且不具特异性，不能提供微生物分类信息。微生物阻抗法可通过测量微生物生长引起的培养基电导率变化来评估微生物风险，但基于培养的方法仍是诊断微生物污染的金标准 。MALDI-TOF MS 作为一种先进的质谱技术，凭借蛋白质谱识别微生物，在微生物诊断领域应用广泛，不过在燃料微生物检测方面的研究尚在探索中。本研究旨在借助两种 MALDI-TOF MS 系统（Bruker Daltonik GmbH 和 Zybio Inc.），识别影响柴油分散稳定性的微生物污染物，并与 16S rRNA 测序技术对比，评估其鉴定准确性。

二、研究材料与方法

（一）材料来源

研究人员于 2022 年 9 月 6 日和 10 月 7 日，从波兰两个加油站的四个不同储油罐中采集柴油燃料样本，涵盖 Ekodiesel Ultra B0、Fuel1（F1）和 Fuel2（F2）三种类型，采样位置包括油罐的上、中、下部分及内部采样器，共计 16 个样本。

（二）物理化学分析

由 Orlen Laboratory（波兰普沃茨克）对燃料样本进行多项物理化学分析，依据相应标准测定十六烷指数（CI）、冷滤点（CFPP）、闪点（FP）、脂肪酸甲酯（FAME）含量、硫含量（S）和污染物含量。

（三）气相色谱

采用配备 TOF 质谱仪的 6890 N 气相色谱仪，使用 Equity-1 毛细管柱对样本进行分析。样本经 PF 过滤、稀释后注入色谱系统，分析结果与标准燃料样本对比，质谱分析在特定条件下进行，数据处理借助 ChromaTOF 软件完成。

（四）细菌培养

从每个燃料样本的上、中、下部分别取样，接种于多种培养基，在有氧和高浓度二氧化碳（5%）条件下培养 5 天，之后运用划线平板法获取纯培养物，再用 MALDI-TOF MS 进行鉴定。

（五）细菌提取物制备

用无菌微生物环收集选定的细菌菌落细胞生物质，以 1:1 的甲酸 / 乙腈混合物进行蛋白质提取，提取物点样于 MALDI 板，干燥后覆盖基质 α-CHCA。

（六）MALDI-TOF MS 分析

运用 Microflex LT MALDI-TOF/TOF 质谱仪（Bruker Daltonik GmbH）和 EXS2600 MALDI-TOF MS（Zybio Inc.）分析样本，所得质谱图经处理后，与各自数据库中的参考谱图比对，依据制造商标准对鉴定分数进行解释。

（七）PCR 鉴定

选取部分细菌菌株，利用特定试剂盒提取基因组 DNA，经检测合格后，使用特定引物进行 16S rRNA 基因 PCR 扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析后测序，测序结果与 GenBank rRNA 数据库比对，符合一定标准后进行分类学鉴定 。

（八）统计分析

运用 PS IMAGO PRO 9.0 软件和 Python（结合 Pandas 和 Matplotlib 库）进行数据分析和图表绘制。采用卡方检验、Wilcoxon 符号秩检验、Mann-Whitney U 检验和 Pearson 相关系数分析等方法，探究数据间的差异和相关性，设定显著性阈值为 0.05。

三、研究结果

（一）柴油燃料的微生物污染

通过样本的浊度和沉积物，可明显看出柴油燃料存在微生物污染。从 16 个样本中总共鉴定出 272 株细菌和真菌，其中真菌仅有 Naganishia 和 Rhodotorula 两个属。需氧或兼性厌氧细菌占主导，嗜二氧化碳菌仅占 1.8% 。不同培养基上细菌生长数量差异显著，Schedler 培养基上细菌生长最佳。革兰氏阳性菌占比高达 92.36%，占据优势。Ekodiesel Ultra B0 燃料中鉴定出的微生物数量最多，Fuel F1 最少。多数微生物存在于燃料罐上部，Fuel F1 罐底部微生物数量也较多，且不同燃料罐不同部位微生物分布各异 。

（二）燃料样本的 MALDI 鉴定水平

Wilcoxon 检验表明，两种 MALDI 系统在鉴定类型上存在显著差异。Zybio 系统在物种水平的鉴定率为 48%，Bruker 系统仅为 33%；Bruker 系统在属水平的鉴定效果相对较好。Zybio 系统的未鉴定样本数是 Bruker 系统的两倍，Bruker 系统在 25% 的样本中未检测到信号。不同燃料样本在两种系统中的鉴定率和未鉴定率有所不同，Ekodiesel Ultra B0 燃料样本的未鉴定率最低 。

（三）Zybio 和 Bruker 系统鉴定的燃料样本中的细菌类别

Zybio 系统将微生物分为 Actinomycetia、Bacilli 和 Gammaproteobacteria 三个类别，Bruker 系统鉴定出 Actinomycetia、Bacilli、Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria 和 Betaproteobacteria 五个类别。Mann-Whitney 检验显示，两种系统对 Actinomycetia 和 Bacilli 类别的鉴定分数存在显著差异。Fuel F1 的微生物类别最为多样，不同燃料类型的各细菌类别分数分布也有所不同 。

（四）两种 MALDI 系统鉴定的燃料样本中的细菌物种

Zybio 系统鉴定出的物种中，Actinomycetia 和 Bacilli 类最为丰富。Bacilli 类中有 16 种不同物种，以 Staphylococcus epidermidis 和 Staphylococcus hominis 居多；Actinomycetia 类中 Micrococcus luteus 占主导。Bruker 系统鉴定出的物种里，Bacilli 类最为多样，有 12 种物种，Staphylococcus epidermidis 和 Staphylococcus hominis 占比较大，Actinomycetia 类中大部分（88%）被鉴定为 Micrococcus luteus 。

（五）细菌物种与燃料理化参数的相关性分析

相关性分析表明，细菌的存在与燃料的污染物含量、FAME 含量和 CFPP 呈显著正相关，与 FP 呈显著负相关。部分特定细菌物种与燃料的某些理化参数也存在显著相关性，如 Acinetobacter schindleri 等与 FAME 含量和污染物呈负相关，与 CI 和 FP 呈正相关 。

（六）柴油燃料的化学特征

对比三种柴油燃料与标准参考样本的化学特征，发现 Ekodiesel Ultra B0 有 25 种独特化合物，F1 有 42 种，F2 有 45 种。这些化合物包括多种烷烃和环烷烃异构体，其含量在不同燃料中存在差异，部分化合物可能与微生物活动相关 。

（七）两种 MALDI 系统的鉴定不匹配情况

两种 MALDI 系统在分数值和参考数据库上的差异导致鉴定不匹配。在高置信度鉴定中，仅有 24% 的物种被两种系统一致鉴定。Bruker 系统高置信度鉴定的部分物种，Zybio 系统因分数值低无法进行物种水平鉴定，Micrococcus luteus 的鉴定差异最为明显 。

（八）MALDI 与 16S rRNA 测序在燃料微生物鉴定中的比较

16S rRNA 测序验证了部分 MALDI 系统的鉴定结果，如 Staphylococcus hominis 和 Micrococcus luteus 。对于 MALDI 系统仅能鉴定到属水平的样本，16S rRNA 测序可实现物种水平鉴定。但也存在一些遗传鉴定与蛋白质组鉴定不一致的情况，表明 MALDI 系统在属和物种鉴定上可能存在问题 。

四、研究结论与讨论

研究表明，MALDI-TOF MS 技术可有效监测燃料储存罐中微生物群落的变化，为早期发现污染问题提供了有力工具。不过，由于燃料中微生物群落的多样性和复杂性，利用该技术鉴定环境细菌仍面临挑战。持续丰富和更新参考数据库、优化样本制备协议以及调整方法，对于提高其在环境微生物学中的准确性和可靠性至关重要。

不同燃料类型中微生物的数量和种类存在显著差异。Ekodiesel Ultra B0 燃料因缺乏生物成分和抗氧化添加剂，微生物数量最多；Fuel F1 虽含添加剂，但底部积水和杂质为微生物生长提供了条件；Fuel F2 含有 FAME，可能因其具有杀菌特性，微生物数量相对较少 。

环境细菌在柴油燃料微生物中占主导地位，好氧或兼性厌氧细菌、革兰氏阳性菌居多。这些微生物具有代谢灵活性和生存机制，能够适应燃料环境，部分还具备降解石油烃的能力，在污染环境生物修复和生物燃料生产研究方面具有潜在价值 。

细菌的存在与燃料理化参数密切相关。FAME 含量高的燃料更易受微生物污染，微生物污染会影响燃料的流动和过滤性能，进而影响 CFPP 参数。此外，燃料中的烃类化合物组成差异可能反映微生物活动水平，但需进一步研究确定其来源 。

两种 MALDI 系统在微生物鉴定上各有优劣，参考数据库的差异是导致鉴定不匹配的重要原因。16S rRNA 测序可辅助验证 MALDI 系统的鉴定结果，提高鉴定准确性，但也存在一定局限性。未来，通过完善参考数据库、改进样本处理方法和分析技术，有望提升 MALDI-TOF MS 技术在燃料微生物检测中的应用效果，保障燃料质量和系统运行效率，推动能源行业的可持续发展 。