内皮细胞SHANK3通过β-Catenin信号传导调节新生小鼠血脑屏障的紧密连接

本研究揭示了新生儿期脑内皮细胞SHANK3缺乏通过β-Catenin失衡破坏血脑屏障功能，导致asd相关的神经元和行为异常。

　　

探究自闭症潜在发病机制：血脑屏障内皮细胞中 SHANK3 基因的关键作用

美国田纳西大学健康科学中心解剖与神经生物学系的研究人员 Yong-Eun Kim 等人在Nature Communications杂志上发表了题为 “Endothelial SHANK3 regulates tight junctions in the neonatal mouse blood-brain barrier through β-Catenin signaling” 的论文。该研究揭示了自闭症风险基因 Shank3 在血脑屏障（BBB）形成的脑内皮细胞（BECs）中的重要作用，为理解自闭症发病机制提供了新视角，有望为自闭症的治疗开辟新方向。

一、研究背景

自闭症谱系障碍（ASD）是一种由遗传和环境因素共同作用导致的神经发育障碍性疾病。尽管血脑屏障作为环境因素进入脑实质的关键屏障，但它在 ASD 发病机制中的作用却知之甚少。SHANK3 基因是 ASD 的风险基因，此前研究主要集中在其在神经元中的功能，而在 BECs 中的作用尚未被探索。血脑屏障的毛细血管壁由相邻的脑内皮细胞构成，这些细胞间的紧密连接（TJs）对于维持血脑屏障的功能至关重要，而目前对于 ASD 的遗传风险如何改变 BECs 的 TJ 完整性并导致血脑屏障破坏，进而引发神经元功能障碍和 ASD 样行为的具体机制仍不清楚。

二、研究材料和方法

（一）实验动物

研究使用了多种小鼠品系，包括 Shank3f/f 小鼠、Tek-Cre 小鼠、Ai-14 小鼠、C3H/HeJ 小鼠和 C57BL/6J 小鼠等。通过特定的交配策略获得不同基因型的小鼠，如条件性 Shank3f/f:Tek-Cre（eShank3-KO）小鼠和 Shank3f/wt:Tek-Cre（eShank3-Het）小鼠等，并对小鼠进行基因分型鉴定。

（二）细胞相关实验

1. Primary BEC isolation and enrichment：利用 Adult Brain Dissociation Kit、CD45 MicroBeads 和 CD31 MicroBeads 等从 8 - 12 周龄小鼠或出生后 5 天（P5）的幼鼠大脑中分离和富集脑内皮细胞（BECs），可用于后续的 RNA 提取、蛋白质分析或细胞培养。
2. Transmission electron microscopy：对 P5 幼鼠进行麻醉和心脏灌注固定，取前额叶皮质（PFC）组织进行处理，制备超薄切片，通过透射电子显微镜观察 BECs 间紧密连接的超微结构，并利用 ImageJ 软件对电子密度进行量化分析。
3. Proteomics：运用 BioID2 方法标记 eSHANK3 相互作用蛋白，经一系列处理后进行液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析，鉴定相互作用蛋白，并通过蛋白质 - 蛋白质相互作用映射和基因本体（GO）分析对数据进行处理。

（三）动物实验相关技术

1. AAV injection into the superficial temporal vein (STV) of pups at postnatal day 0：在 P0 幼鼠的浅颞静脉注射腺相关病毒（AAV），如 AAV-PHP.eB-CaMKIIα-EGFP 用于标记神经元，AAV-PHP.v1-CLDN5-GSK3βS9A-HA 用于激活 GSK3β 信号通路，同时设置对照组注射 AAV-PHP.v1-CLDN5-HA。
2. In vivo BBB permeability assay：通过腹腔注射荧光素钠，在特定时间后收集血液和大脑组织，处理后用荧光分光光度计测量荧光强度，以评估血脑屏障的通透性。
3. Electrophysiology：对注射相关 AAV 的小鼠在不同年龄进行麻醉、断头取脑，制备脑切片，通过电流钳记录 PFC 区域锥体神经元的电生理活动，分析动作电位频率和静息膜电位。
4. Behavioral tests：运用超声发声（USV）测试评估幼鼠的交流能力；使用圆形社交竞技场（RSA）测试、梳理行为测试、埋珠测试、开放场测试和明暗箱测试分别评估小鼠的社交行为、重复性刻板行为、运动能力和焦虑水平。

（四）关键技术路线

研究人员首先对 BECs 中 Shank3 的表达进行分析，构建内皮细胞特异性 Shank3 敲除小鼠模型，检测其血脑屏障通透性、神经元兴奋性和行为学变化。接着探究 eSHANK3 在 BECs 中的相互作用蛋白，分析其对紧密连接的影响及相关机制。最后通过药物处理和基因干预等实验，验证 β-Catenin 信号通路在其中的作用，明确该通路对血脑屏障功能、神经元功能和行为学异常的影响。

三、研究结果

（一）A novel form of Shank3 is expressed in BECs

通过 PCR 分析发现，Shank3 是 BECs 中唯一表达的 Shank 家族成员，且脑内皮细胞中的 Shank3 缺少外显子 18（Shank3Δe18）。原位杂交组织化学分析证实了 eShank3 在脑血管内皮细胞中的表达。进一步研究发现，新生小鼠（P5）BECs 中 eShank3 mRNA 的表达显著高于成年小鼠，且在性别间无差异。免疫细胞化学分析表明，eSHANK3 蛋白主要表达于 ZO1 阳性的细胞间连接区域，提示其可能在调节 BECs 连接特性和血脑屏障功能中发挥作用。

（二）Increased BBB permeability in male eShank3-KO neonates

构建的内皮细胞特异性 Shank3 敲除小鼠（eShank3-KO）实验显示，P5 雄性 eShank3-KO 小鼠的血脑屏障通透性显著增加，而雌性小鼠无此现象。通过对不同脑区的分析发现，雄性小鼠的前额叶皮质、大脑皮层和小脑等区域血脑屏障通透性增加，而雌性小鼠各脑区均未出现高通透性。IgG 渗漏实验表明，血脑屏障通透性增加并非由跨细胞转运改变引起。

（三）Endothelial Shank3-KO reduces neuronal excitability and ultrasonic communication in male neonates

免疫组化分析显示，P5 雄性 eShank3-KO 小鼠内侧前额叶皮质和躯体感觉皮质区域的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达显著增加，提示可能存在雄性特异性神经元功能障碍。对 P5 小鼠神经元兴奋性的检测发现，雄性 eShank3-KO 小鼠的动作电位频率显著降低，而雌性小鼠无明显变化，且两组小鼠的静息膜电位均无显著改变。在超声发声测试中，P5 雄性 eShank3-KO 小鼠发出的超声叫声数量和平均持续时间显著减少，而雌性小鼠未出现这种交流障碍。

（四）Normal BBB permeability while sustained neuronal and behavioral abnormalities in adult male eShank3-KO mice

成年 eShank3-KO 小鼠的血脑屏障通透性在雄性和雌性中均恢复正常，且 GFAP 表达与对照组无差异，表明血脑屏障损伤可能在成年期通过代偿机制恢复。然而，成年雄性 eShank3-KO 小鼠的神经元兴奋性仍然降低，在社交行为测试中，雄性 eShank3-KO 小鼠对社交刺激的偏好减少，直接社交互动（嗅探）时间显著缩短，而雌性小鼠社交行为正常。此外，雄性 eShank3-KO 小鼠在梳理和埋珠测试中表现出显著增加的重复性行为，而在开放场和明暗箱测试中，各组小鼠的运动功能和焦虑水平均正常。

（五）eSHANK3 interacts with tight junction proteins in BECs

利用 BioID2 方法鉴定出 376 种与 eSHANK3 相互作用的蛋白质，GO 分析显示这些蛋白质主要与膜和细胞连接功能相关。免疫沉淀分析证实了 eSHANK3 与 ZO1、Claudin5 和 β-Catenin 等关键紧密连接蛋白的相互作用，表明 eSHANK3 可能参与维持 BECs 紧密连接的完整性。

（六）eSHANK3 deficiency disrupts tight junctions in BECs

通过 CRISPR 策略构建稳定的 eShank3-KO bEnd.3 BEC 细胞系，免疫细胞化学和蛋白质免疫印迹分析发现，eShank3 缺失导致 ZO1 和 Claudin5 表达减少、不连续且呈斑片状。透射电子显微镜观察显示，P5 雄性 eShank3-KO 小鼠 BECs 间紧密连接结构异常，电子密度扫描分析表明其细胞间裂隙的电子密度改变，而雌性小鼠的这种结构异常不明显。

（七）eSHANK3 regulates ZO1 and Claudin5 via β-Catenin signaling

研究发现 eSHANK3 与 β-Catenin 破坏复合物蛋白相互作用，eShank3-KO 导致 BECs 中总 β-Catenin 和活性磷酸化 β-CateninS552 在细胞质和细胞核中积累。用 Wnt/β-Catenin 抑制剂 IWR-1-endo 处理 eShank3-KO bEnd.3 BECs 后，β-Catenin 水平恢复正常，ZO1 和 Claudin5 的表达也得到恢复，同时血脑屏障通透性相关指标改善。构建稳定表达组成型活性 GSK3βS9A 的 eShank3-KO BEC 细胞系和过表达 C/EBPα 的 eShank3-KO BEC 细胞系，实验结果进一步证实了 eSHANK3 通过 β-Catenin 信号通路调节 ZO1 和 Claudin5 的表达，影响紧密连接完整性和血脑屏障功能。

（八）GSK3β activation in BECs restores BBB and neuronal dysfunctions in eShank3-KO mice

在 eShank3-KO 小鼠的 BECs 中特异性表达 GSK3βS9A，结果显示雄性 eShank3-KO 小鼠新生儿期升高的血脑屏障通透性恢复正常，成年期神经元兴奋性也恢复正常，而雌性小鼠在各指标上均无明显变化，表明激活 BECs 中的 GSK3β 可以改善 eShank3-KO 小鼠的血脑屏障和神经元功能障碍。

（九）GSK3β activation in BECs restores social behavioral deficits in eShank3-KO mice

在社交行为测试中，表达 GSK3βS9A 的雄性 eShank3-KO 小鼠进入社交区域的频率显著增加，嗅探社交刺激的时间恢复正常，而雌性 eShank3-KO 小鼠社交行为原本正常，不受 GSK3βS9A 表达的影响。此外，各组小鼠在运动功能和焦虑水平相关测试中均无显著差异，表明激活 BECs 中的 GSK3β 可以恢复 eShank3-KO 小鼠的社交行为缺陷，且 eShank3 缺失和 GSK3βS9A 过表达均不影响小鼠的运动性能和焦虑样行为。

四、研究结论和讨论

研究表明，ASD 风险基因 Shank3 在血脑屏障形成的脑内皮细胞中表达，其缺失会破坏紧密连接的完整性，通过 β-Catenin 信号通路的失衡导致新生儿期血脑屏障通透性增加，进而影响神经元兴奋性和行为。虽然成年后血脑屏障通透性恢复，但神经元和行为异常仍然存在，尤其是在雄性小鼠中更为明显。该研究首次揭示了血脑屏障内皮细胞中 Shank3 基因在 ASD 发病机制中的重要作用，强调了新生儿期 BECs 作为 ASD 潜在治疗靶点的意义。

研究还意外发现 eShank3-KO 小鼠中雄性占主导的表型，这与 ASD 在男性中更高的患病率相符，但具体机制尚待进一步研究。此外，eShank3 缺失导致的血脑屏障功能障碍仅在新生儿期的特定时间点出现，却对成年后的神经元和行为产生持续影响，其详细的致病机制和时间框架也需要进一步探索。未来研究可以聚焦于其他 ASD 相关基因在 BECs 中的功能，这将有助于更全面地理解 ASD 的发病机制，为开发针对 ASD 的治疗策略提供新的方向和理论依据。