利用三因子释放金属-有机框架包被纳米线阵列空间控制干细胞的多细胞分化

创建多细胞分化组织对于创建逼真的组织模型非常重要。在这里，作者报告了功能对齐的纳米粒子捕获纳米模式阵列，它允许在阵列上自动成骨，促进在单一平台上的空间控制的多细胞分化，而无需外部输入。

　　

功能化纳米图案阵列：实现干细胞空间可控多细胞分化的新突破

在再生疗法和药物筛选领域，构建更精准、高效的体外模型一直是研究的关键方向。韩国成均馆大学（Sungkyunkwan University，SKKU）智能精准医疗融合系的研究人员 Yeon-Woo Cho、Min-Ji Kang 等人在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Spatially controlled multicellular differentiation of stem cells using triple factor-releasing metal–organic framework-coated nanoline arrays” 的论文。该研究成果为体外细胞模型的构建带来了新的突破，有望推动再生医学和药物研发领域的发展。

一、研究背景

在药物研发过程中，临床前阶段传统的动物实验面临着诸多挑战。由于物种特异性，动物实验结果难以准确预测药物在人体中的效果，导致研发成本增加和时间延长。动物实验还引发了一系列伦理问题。为解决这些问题，科研人员致力于开发体外药物筛选模型。从简单的二维单层细胞培养到复杂的三维多细胞系统，如球体、类器官和器官芯片等，这些模型旨在更好地模拟真实器官或组织的结构复杂性，但在构建过程中仍面临不少困难。

间充质干细胞（MSCs）因其具有多能性，可分化为多种细胞类型，且易于从成人组织中提取，安全性较高，成为构建体外模型的理想细胞来源。在培养 MSCs 时，整个细胞群体暴露于相同的分化培养基中，难以实现空间可控的分化。构建模拟器官结构的多细胞体外模型时，需要进行细胞分离、精确重新接种和细胞重新附着等繁琐且耗时的步骤，还可能对细胞造成损伤。若要创建不同细胞类型共存的界面区域，难度则更大。

基于此前研究发现纳米图案和底物弹性等物理信号可影响干细胞分化，研究人员提出假设：同时给予细胞物理（如纳米图案）和生化信号（如分化因子），或许能更精确地调控干细胞分化，这对于构建模拟复杂器官结构的组织模型至关重要。

二、研究材料与方法

（一）材料

研究选用了 Zr?O?(OH)?(BPDC)?（UiO - 67，BPDC 为 4,4′ - 联苯二甲酸）作为载体，用于负载抗坏血酸（AA）、β - 甘油磷酸（BGP）和地塞米松（DEXA）这三种诱导 MSCs 成骨分化的关键因子。实验细胞为人骨髓间充质干细胞（MSCs），购自美国典型培养物保藏中心。实验还用到了 ITO 涂层玻璃、光刻胶、TWEEN20、PDMS 等多种化学试剂和材料。

（二）方法

1. 纳米图案阵列的制备：采用激光干涉光刻（LIL）技术，以劳埃德镜作为干涉仪系统制备纳米图案阵列。先对 ITO 涂层玻璃进行清洗、干燥和加热处理，然后旋涂负性光刻胶，经两次紫外激光曝光、加热、显影等步骤，在同一基底上形成纳米孔和纳米线图案。通过调整曝光剂量和角度等参数，可控制图案的尺寸。
2. ODF - FANTA 的制备：将 UiO - 67 纳米颗粒超声分散后，浸入含有 AA、BGP、DEXA 和 10% DMSO 的 ODF 混合物中孵育，制备出 ODF?UiO - 67。对纳米图案阵列进行氧等离子体处理后，采用不对称旋涂（ASC）技术，将 10mg/mL 的 ODF?UiO - 67 涂覆在纳米线阵列上，实现选择性捕获。
3. 细胞培养与分化：在接种 MSCs 前，对不同的处理基底（ITO 涂层玻璃、纳米线阵列、FANTAs 和 ODF - FANTAs）进行预处理，如固定培养小室、消毒等。将 MSCs 以 1.47×10? cells/cm2 的密度接种在基底上，在标准条件下培养，定期更换培养基。根据不同实验目的，在细胞达到一定融合度后，添加成骨或成脂分化培养基诱导分化。
4. 分析方法：通过染色实验（如茜素红 S 染色、油红 O 染色、BODIPY 染色等）、免疫细胞化学和 RT - qPCR 等方法，对 MSCs 的成骨和成脂分化进行监测和分析。例如，茜素红 S 染色用于定量分析分化细胞中的钙沉积，油红 O 染色用于观察脂肪细胞中的脂滴，RT - qPCR 用于检测成骨和成脂相关基因的表达。

（三）关键技术路线

本研究的关键技术路线围绕功能化纳米颗粒捕获纳米图案阵列（FANTAs）展开。首先设计并合成能够持续释放三种成骨分化因子的 UiO - 67 金属有机框架纳米颗粒，利用其孔径优势实现分化因子的长期稳定释放。通过激光干涉光刻技术制备纳米孔和纳米线阵列，为细胞提供不同的物理信号。在制备 FANTAs 时，采用优化的不对称旋涂方法，使 UiO - 67 纳米颗粒以 99.8% 的效率选择性地捕获在纳米线阵列上。将 MSCs 接种在 FANTAs 上，在成脂分化培养基的作用下，利用纳米图案的物理信号和 UiO - 67 释放的生化信号，实现 MSCs 在单一基底上的空间可控多细胞分化，生成脂肪细胞、成骨细胞以及两者的混合物。

三、研究结果

（一）三重分化因子释放 MOF 纳米颗粒的设计、合成与表征

研究人员选择 UiO - 67 作为载体，是因其 1.89nm 的孔径适合负载 AA、BGP 和 DEXA 这三种成骨分化因子并实现其长期释放。合成的 UiO - 67 纳米颗粒尺寸均匀，约为 170nm，呈截角八面体几何形状。粉末 X 射线衍射（PXRD）图谱证实其具有高度结晶性，氮吸附 - 解吸等温线显示其具有典型的微孔材料性质，比表面积为 2192.80m2/g，总孔体积为 0.369cm3/g（P/P? = 0.98）。

实验发现，UiO - 67 颗粒在与 AA 和 BGP 孵育 48h 内达到饱和，而与 DEXA 孵育则需要 60h，这可能是由于 DEXA 分子量较大。UiO - 67 对 AA、BGP 和 DEXA 的最大负载量分别为 49.80、50.49 和 2.36×10?3mmol/g。将三种因子混合后，UiO - 67 仍能有效负载且保持吸收动力学。在 Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）溶液中，饱和的 UiO - 67 颗粒在 21d 内呈现出逐渐且稳定的 ODF 累积释放，无初始爆发释放或释放不稳定现象，且单因子和混合因子的释放曲线无显著差异，表明各因子在吸收和释放过程中无干扰。

（二）FANTA 的制备

利用激光干涉光刻技术在统一基底上成功制备出纳米线和纳米孔阵列。在旋涂 UiO - 67 颗粒的过程中，研究人员通过改变旋涂速度、滴加方式、溶液粘度和基底亲水性等条件，优化颗粒捕获效率。实验发现，TWEEN20 可调节溶液粘度和纳米颗粒分散性，当旋涂速度为 3500rpm、时间为 120s、滴加方式为旋涂前滴加时，能有效捕获 UiO - 67 纳米颗粒，但基底的疏水性会导致颗粒聚集。经氧等离子体处理后，纳米线阵列中捕获的纳米颗粒数量增加，是对照组的约 3.22 倍。

进一步研究发现，基底边缘的纳米线阵列中 MOF 纳米颗粒饱和度更高，这是由于离心力随距离中心的增加而增大。基于此，采用不对称旋涂法，将纳米线和纳米孔阵列分别置于基底的外侧和中心区域，实现了 MOF 纳米颗粒在纳米线阵列中的选择性捕获，捕获效率高达 99.8%，成功制备出集成空纳米孔图案和负载 ODF?UiO - 67 纳米线阵列的单一平台。

（三）MSCs 在负载 ODF 纳米线图案阵列上的自动成骨分化

研究人员通过改变纳米孔和纳米线阵列的尺寸和间隙距离，制备了不同的基底，评估其对 MSCs 生长、粘附和分化的影响。结果表明，800S 纳米孔和纳米线阵列的细胞外基质沉积和细胞生长明显增强，证实了其良好的生物相容性和无毒性。纳米孔图案限制细胞粘附，减少了有利于成骨的整合素亚基（ITGa1）的表达，促进了 MSCs 的成脂分化，纳米孔阵列上的脂滴数量和大小分别比平坦基底上的 MSCs 增加了 2.27 倍和 4.59 倍。相比之下，纳米线阵列有利于成骨分化，其中 800S 纳米线阵列对引导细胞形态向有利于成骨的细长形状发展尤为有效，成骨细胞形成量增加到对照组的 2.53 倍。

利用负载 ODF?UiO - 67 的 800S 纳米线阵列进行成骨分化实验，通过改变 MOF 中的 ODF 成分，评估不同组合对成骨的影响。结果显示，包含所有三种 ODF 的 MOF 纳米线阵列成骨效率更高。在整个分化过程中，未检测到细胞对 MOF 纳米颗粒的摄取，且 ODF 从纳米线阵列中稳定释放 21d。与其他平台相比，负载 ODF?UiO - 67 的纳米线阵列（ODF - FANTAs）在成骨分化过程中，OCN 表达和矿化水平显著更高。分化四周后，ODF - FANTAs 组的磷酸钙积累（矿化）和 OCN 蛋白表达分别比对照组高 26.53 倍和 2.64 倍。抑制 BMP - 2 信号通路后，MSCs 在 ODF?UiO - 67 嵌入阵列上的成骨效率极低，表明其通过典型的 TAB、TAK 和 Smad 途径形成成骨细胞。

（四）统一 FANTA 平台上 MSCs 的空间可控多细胞分化

为模拟功能性骨 - 脂界面，在 FANTA 平台上进行空间可控的骨 - 脂分化实验。实验假设 MSCs 在纳米孔上会因培养基中的成脂分化因子和纳米拓扑效应发生成脂分化；在纳米线阵列上会因 MOF 持续释放的 ODF 和纳米线引导的细长形态自动分化为成骨细胞；在纳米孔 - 纳米线界面层会同时产生脂肪细胞和成骨细胞。

经过三周的分化，在纳米线 - 纳米孔界面和纳米孔阵列区域均观察到脂滴。免疫细胞化学染色显示，OCN 和 BODIPY 分别主要在负载 ODF?UiO - 67 的纳米线和纳米孔图案阵列中表达。在界面区域，脂肪细胞和成骨细胞共存，OCN 表达比 BODIPY 高 2.56 倍。茜素红 S（ARS）和油红 O（ORO）染色结果表明，纳米线阵列上的矿化水平比纳米孔阵列高 5.39 倍，纳米孔阵列上的脂滴沉积比纳米线阵列高约 3.01 倍。通过钙染色测量成骨区域，发现钙沉积区域在纳米孔阵列中占 1.58±0.51%，在纳米线阵列中占 98.33±0.47%，表明扩散主要发生在 MOF 嵌入区域，证明了 FANTA 平台对 MSC 分化的精确控制能力。此外，通过调整纳米线阵列的形状和尺寸，可更准确地模拟骨髓界面。

研究人员还尝试在 FANTA 平台上诱导生成神经元和软骨细胞。由于 MSCs 分泌的细胞因子会导致神经元凋亡，且软骨形成所需的蛋白质补充剂会影响成骨，因此采用 PDMS 掩模在特定区域诱导分化。结果成功诱导出神经元和软骨细胞，效率分别为 96% 和 91%，同时伴有成骨，展示了 FANTA 平台在体外生成特定器官或组织结构的潜力。

四、研究结论与讨论

本研究成功制备了可在指定纳米图案上近乎完美捕获三重因子释放 MOF 纳米颗粒的 FANTA 平台，实现了高效成骨分化和空间可控的多细胞分化。在高效成骨方面，通过物理和生化信号的协同作用，分化效率提高了 80 倍。在空间可控多细胞分化上，分化选择性超过 98%。

与先前的细胞分化自动化方法（如微流体或生物打印设备）相比，FANTA 平台具有显著优势。它结构简单，类似组织培养板，易于一次性使用，完全兼容现有细胞培养协议，无需复杂的实验设置，如微流体通道、外部控制泵和大量仪器设备，这使得大多数生物学研究能够更便捷地应用该平台。

FANTA 平台可通过结合更多关键分化因子（如 CHIR、BMP、bFGF、BDNF 和 FGF 等）和其他纳米材料（如介孔二氧化硅纳米颗粒、脂质纳米颗粒和可生物降解的聚合物纳米颗粒）进一步升级，这些材料能够携带高分子量的因子，从而拓展其应用范围。该平台还能有效减少复杂器官模拟构建过程中的批次间差异，提高体外模型的可靠性和实用性，为骨质疏松症等疾病的高级药物筛选提供了更可靠的模型，在生物医学研究和治疗发展（包括基于患者特异性干细胞的治疗）方面具有重要的推动作用。

韩国成均馆大学研究人员的这项研究成果，为再生疗法和药物筛选领域提供了创新的体外模型构建方法，有望在未来转化医学中发挥重要作用，推动相关疾病治疗手段的进步。