基于咪唑并吡嗪激酶抑制剂的 photoaffinity 探针蛋白质组选择性分析揭示激酶抑制剂脱靶效应调控新机制

本研究针对激酶抑制剂选择性评估难题，开发了基于咪唑并吡嗪（imidazopyrazine）骨架的 photoaffinity 探针（PAL），通过化学蛋白质组学技术系统解析了 KIRA6、acalabrutinib 和 linsitinib 衍生物探针的脱靶谱，发现其选择性差异与 1-位取代基的空间构象和刚性密切相关，为理性设计高选择性激酶抑制剂提供了新思路。

　　

激酶作为药物研发的重要靶点，其抑制剂的选择性一直是领域内的核心挑战。尽管已有80余种激酶抑制剂获批用于癌症等疾病治疗，但由于ATP结合位点的高度保守性，设计高选择性抑制剂仍面临巨大困难。更复杂的是，近年研究发现激酶抑制剂的适度多靶点特性（polypharmacology）可能通过调控冗余信号通路增强疗效，这使得全面评估抑制剂与全蛋白质组的相互作用变得至关重要。

比利时鲁汶大学Steven H.L. Verhelst团队在《Communications Chemistry》发表研究，通过将临床阶段激酶抑制剂KIRA6（靶向IRE1α）、acalabrutinib（FDA批准的BTK抑制剂）和linsitinib（IGF-1R抑制剂）改造为光亲和标记探针（photoaffinity probes），结合化学蛋白质组学技术，首次系统揭示了咪唑并吡嗪骨架的全局蛋白质组相互作用谱。研究发现，这类抑制剂的脱靶数量差异可达4倍（KIRA6探针10个 vs linsitinib探针42个），且选择性与其1-位取代基的立体构象和分子刚性显著相关。

研究采用三大关键技术：1）光亲和标记探针的理性设计（保留母核结构，C3位引入炔烃-二氮嗪光交联基团）；2）基于LC-MS/MS的化学蛋白质组学分析（A431细胞裂解液体系）；3）分子动力学模拟（50 ns水相轨迹）结合分子对接（AutoDock Vina）。

结果部分核心发现：

探针设计与验证
通过保留母核关键药效团、替换溶剂暴露区基团的策略，成功构建三个探针（1、9a、9b）。凝胶电泳显示所有探针均呈现浓度依赖性标记模式，且标记信号可被母体抑制剂竞争性抑制。值得注意的是，linsitinib探针9b在A375细胞中特异性标记30 kDa蛋白，而KIRA6探针1在Ramos细胞中优先标记75 kDa蛋白，提示探针间存在选择性差异。

蛋白质组尺度脱靶鉴定
通过竞争性化学蛋白质组学（阈值设定：vs DMSO富集≥2倍且vs竞争组降低≥2倍），鉴定出KIRA6、acalabrutinib和linsitinib探针分别有10、32和42个高置信度靶点。虽然三个探针均未捕获其首要靶点（可能因细胞系低表达或光交联位点限制），但发现了大量激酶（如CSNK1A1、CSNK1D）和核苷酸结合蛋白（如GNAI1、IDH2）。特别值得注意的是，约50-90%的脱靶蛋白与已知激酶存在相互作用网络，暗示这些"脱靶"可能通过蛋白-蛋白相互作用被间接捕获。

构效关系分子机制
分子动力学模拟揭示：KIRA6探针因1-位取代基体积最大（体积波动范围628-998 ?³）且构象灵活，表现出最高选择性；而linsitinib探针因刚性环丁基取代（体积219-360 ?³）和固定空间取向，更易结合多种核苷酸结合蛋白。分子对接进一步证实，linsitinib刚性结构对ATP结合蛋白具有更广泛的结合适应性，其与IDH2等靶点的预测结合能显著优于acalabrutinib（p<0.001）。

结论与意义
该研究建立了咪唑并吡嗪类激酶抑制剂的"结构-脱靶谱"定量关系模型，证明1-位取代基的立体体积和构象自由度是调控选择性的关键因素。这不仅为优化激酶抑制剂选择性提供了新策略（如通过增大取代基体积或引入构象约束），其开发的模块化探针设计方法更可推广至其他抑制剂骨架的全局靶标鉴定。研究还提示，传统激酶组筛选可能低估了抑制剂与核苷酸结合蛋白的交叉反应性，而化学蛋白质组学能更全面地评估药物脱靶风险。

这项工作的创新性在于：首次将光亲和标记探针的蛋白质组选择性差异与分子构象动力学直接关联，为基于结构的理性药物设计提供了新维度。未来扩展更多结构变体探针库，有望建立更精确的激酶抑制剂选择性预测模型。