肝脏 X 受体 α（LXRα）的一种突变揭示胆固醇感应在限制代谢功能障碍相关脂肪性肝炎中的作用
摘要：肝脏 X 受体 α（LXRα）作为细胞内胆固醇传感器，通过直接结合胆固醇衍生物，在转录水平上调节脂质代谢。美国弗吉尼亚大学医学院药理学系的研究人员培育出了 LXRα 发生突变的小鼠，该突变降低了其对内源性胆固醇衍生的 LXR 配体的反应活性，但仍能被合成激动剂激活转录。突变的 LXRα 起到显性负调控作用，阻断了胆固醇感应。在喂食高脂肪、高胆固醇饮食后，LXRα 突变小鼠迅速出现与代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）相关的病理特征，包括肝细胞气球样变、肝脏炎症和纤维化。值得注意的是，LXRα 突变小鼠肝脏甘油三酯减少，但肝脏胆固醇增加。因此，肝脏中升高的胆固醇可能在 MASH 的发展中起关键作用。用合成激动剂治疗重新激活 LXR 信号通路，可逆转 LXRα 突变小鼠的 MASH 症状，这表明 LXRα 通常起到阻止肝脏疾病发展的作用。
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，以前称为非酒精性脂肪性肝病），据估计，在美国约 25% 的成年人和全球 35% 的成年人受其影响。MASLD 本身可能相对良性，但约 25% 的患者会进展为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH，以前称为非酒精性脂肪性肝炎），其特征为肝细胞气球样变、肝脏炎症和纤维化。重要的是，MASH 会增加肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭的风险。然而，触发 MASLD 进展为 MASH 的过程，甚至是否存在从一种病理状态到另一种病理状态的真正逐步进展，仍有待确定。MASLD 的特征是肝脏中脂肪过度积累，并且经常观察到从头脂肪酸合成速率升高。由于大多数 MASLD 患者没有 MASH，目前尚不清楚肝脏脂肪增加是否单独驱动向 MASH 的转变，或者是否还需要其他触发因素。
在人类中，肝脏胆固醇水平与 MASH 的严重程度相关，临床研究表明，MASH 患者可以从使用他汀类药物抑制胆固醇合成中获益。此外，大多数依赖高脂肪饮食的 MASH 啮齿动物模型也需要高水平的饮食胆固醇来促进疾病发展。细胞内高胆固醇具有毒性，可导致内质网应激、炎症和细胞死亡，这些都被认为与 MASH 的发生有关。然而，胆固醇直接影响该疾病的机制尚未完全明确。肝脏 X 受体 LXRα（Nr1h3）和 LXRβ（Nr1h2）是配体激活的转录因子核激素受体超家族的成员，是胆固醇和脂肪酸代谢的重要调节因子。通过直接结合胆固醇衍生物，包括氧化形式的胆固醇（氧固醇），LXRs 能够感知细胞内胆固醇水平的变化，并调节基因表达以维持脂质稳态。与许多核受体一样，在没有激动剂配体的情况下，LXRs 可以与抑制转录的共抑制蛋白相互作用。内源性或合成激动剂的结合会导致 LXR 配体结合域的构象变化，减少与共抑制蛋白的相互作用，并促进与共激活蛋白的结合，从而增加 LXR 调节基因的转录。肝脏中主要表达的 LXR 亚型 LXRα 的基因敲除，会损害胆固醇的分解代谢和排泄，同时也会减少从头脂肪酸合成。与基因数据一致，分子研究表明，LXRs 直接调节参与胆固醇排泄、胆固醇合成胆汁酸以及脂肪酸合成的基因转录。由于脂肪酸合成增加被认为是 MASLD 中脂肪变性的主要驱动因素，因此抑制 LXR 活性被提出作为治疗脂肪性肝病的一种潜在治疗方法。事实上，用合成的 LXR 拮抗剂治疗，可减少饮食诱导的小鼠肝脂肪变性模型中的肝脏脂质积累。另一方面，用合成激动剂增加小鼠的 LXR 活性，可促进肝脏胆固醇排泄、胆固醇从体内的净排出，并减轻炎症。因此，即使在肝脏和血浆甘油三酯水平大幅增加的情况下，LXR 激活在包括 II 型糖尿病和动脉粥样硬化在内的慢性代谢疾病模型中也具有有益作用。支持小鼠模型的研究，人类全基因组关联研究已经确定了人类 LXRα 基因（NR1H3）中的变异与脂质水平和胰岛素敏感性相关。LXRα 中的罕见变异也与肝损伤标志物相关，这表明 LXRα 在维持正常肝功能方面具有重要作用。
美国弗吉尼亚大学医学院药理学系的研究人员培育出了将 LXRα 基因第 441 位氨基酸处的保守色氨酸突变为苯丙氨酸（W441F）的小鼠。W441F 突变损害了 LXRα 对源自内源性胆固醇的配体的转录反应，但仍允许通过强效合成激动剂进行转录调节。LXRα W441F 作为一种显性负调控受体，在体内抑制 LXR 依赖的转录。突变小鼠肝脏中积累胆固醇，并表现出促炎和促纤维化基因表达增加。在对高脂肪、高胆固醇饮食的反应中，W441F 小鼠迅速出现类似 MASH 的表型，包括肝细胞气球样变、免疫细胞浸润和纤维化。用合成的 LXR 激动剂治疗 W441F 小鼠，重新激活 LXR 信号通路，可逆转胆固醇积累、炎症和纤维化，这表明 LXRs 通常起到阻止 MASH 发展的作用。
结果
LXRα W441F 的特征
结构研究和报告基因分析表明，将 LXR 配体结合域羧基末端螺旋 12 中的保守色氨酸（小鼠 LXRα 中的第 441 位氨基酸）突变为苯丙氨酸，会削弱其与螺旋 10 中的组氨酸（小鼠 LXRα 中的第 419 位氨基酸）之间的 π- 阳离子相互作用，而这种相互作用是 LXRs 对胆固醇衍生配体的转录反应所必需的。然而，像 T0901317 这样能直接与组氨酸 419 形成氢键的强效合成配体，其转录激活对突变为苯丙氨酸的变化不太敏感。为了在更相关的环境中探究 W441F 突变的影响，研究人员用表达小鼠 LXRα 或 LXRα W441F 的腺病毒感染了源自 LXRα + LXRβ 双敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞，并对编码固醇调节元件结合蛋白 1c（Srebp1c）和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1（Scd1）这两个已被充分表征的 LXR 靶基因的 mRNA 进行了定量分析。用单独表达 GFP 的病毒感染的细胞作为对照。正如预期的那样，野生型 LXRα 在响应氧固醇 24 (s),25 - 环氧胆固醇以及合成激动剂 T0901317 时，会增加基因表达。相比之下，表达 LXRα W441F 的细胞对 24 (s),25 - 环氧胆固醇的反应选择性丧失。剂量反应分析表明，在表达 LXRα W441F 的细胞中，T0901317 的半数有效浓度（
）增加了 5 倍，并且其最大效应相对于表达野生型 LXRα 的细胞有所降低。像 GW3965 和 BMS852927 这样不与组氨酸 419 形成氢键的合成激动剂，激活 LXRα W441F 的能力很小或没有。蛋白质免疫印迹表明，突变蛋白的表达水平高于野生型 LXRα，这与已发表的研究结果一致，即 LXR 的半衰期与转录活性相关。
为了在体内研究 W441F 突变的后果，研究人员使用 CRISPR 技术将该突变引入 Lxrα（Nr1h3）基因座。杂合突变小鼠（称为 W/F）的繁殖产生了符合孟德尔遗传比例的纯合野生型（称为 W/W）和纯合突变型（称为 F/F）后代。在 10 - 12 周龄时，W/W、W/F 和 F/F 雌性或雄性小鼠之间的体重没有显著差异，并且所有小鼠看起来都正常。然而，与对照组相比，W441F 小鼠肝脏和肠道中参与胆固醇代谢和脂肪酸合成的 LXR 调节基因显著减少，纯合（F/F）突变小鼠的减少程度相对杂合（W/F）突变小鼠更为明显。蛋白质免疫印迹显示，三种基因型小鼠肝脏核提取物中 LXRα 蛋白水平大致相等，这表明观察到的基因表达变化并非由 W441F 蛋白水平降低引起。相应地，血浆甘油三酯和胆固醇水平也降低，这反映了 LXRs 在促进极低密度脂蛋白（VLDL）分泌以及高密度脂蛋白颗粒产生中的已知作用。突变小鼠的血浆葡萄糖水平略低，然而，这种葡萄糖的降低可能是肝脏损伤的继发效应。与 LXRα 在调节胆汁酸合成中的已知作用一致，W441F 小鼠的粪便胆汁酸也减少。由于 LXRα W441F 不能被内源性胆固醇衍生的配体激活，研究人员认为突变受体通过与 DNA 结合但无法激活转录，起到转录的显性负调控抑制剂的作用。事实上，在 AML12 小鼠肝细胞中过表达 LXRα W441F 会抑制 LXR 靶基因的表达。
通过苏木精和伊红（H&E）染色对肝脏切片进行组织学检查，发现纯合 F/F W441F 小鼠存在免疫细胞浸润的证据。此外，通过对纯合 F/F 突变切片进行油红染色，选择性地检测到大量中性脂质聚集。组织脂质定量分析表明，杂合 W/F 和纯合 F/F 小鼠的肝脏甘油三酯均减少。另一方面，肝脏胆固醇仅在纯合 F/F 突变小鼠中增加，这表明油红 O 染色很可能识别出了富含胆固醇的细胞。与参与脂肪酸合成的基因相比，参与胆固醇分解代谢的 LXR 靶基因在杂合突变体中受影响较小，这一观察结果可能解释了基因剂量对肝脏胆固醇积累的影响。F/F 小鼠还选择性地出现肝肿大，表现为肝脏与体重的比值增大。此外，在 F/F 肝细胞核中检测到识别增殖标记物 Ki67 的抗体染色增加，表明细胞正在进行分裂。先前的研究表明，具有转录活性的 LXRs 通过限制支持细胞增殖所需的胆固醇供应来抑制细胞生长。在纯合 F/F 突变小鼠中测量到的肝细胞增殖增加支持了早期的研究工作，并进一步表明 LXR 信号通路通常会限制肝细胞生长。最后，F/F 小鼠血浆中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平升高，这表明存在肝损伤。
为了进一步探究三种基因型小鼠肝脏基因表达的差异，研究人员进行了 RNA 测序（RNA-Seq）。肝脏基因表达的主成分分析（PCA）表明，W/F 杂合子与 W/W 对照组更为相似，而与杂合 F/F 突变体差异较大。与 W/W 对照组相比，W/F 杂合子肝脏中有 59 个基因表达失调（39 个下调，20 个上调）。基因本体分析表明，大多数下调基因与脂肪酸代谢相关，其中 18 个是已确定的 LXR 靶基因，或者是通过染色质免疫沉淀测序鉴定出附近存在 LXR 结合位点的基因。W/F 小鼠中唯一显著上调的途径包括 4 个诱导 2 - 2.3 倍的基因，这些基因与固醇代谢相关。相比之下，与 W/W 对照组相比，F/F 纯合突变小鼠肝脏中有超过 2000 个基因差异表达（488 个下调，1688 个上调）。F/F 肝脏中下调的基因也主要与脂肪酸代谢相关。F/F 肝脏中选择性上调的主要基因网络包括与细胞分裂、炎症 / 免疫细胞功能以及细胞粘附 / 细胞外基质相关的网络。通过定量 PCR 证实了代表性的基因表达变化。趋化因子受体 Cx3cr1 的表达增加，以及促炎基因如 Tnf 的表达升高，与 H&E 染色观察到的免疫细胞浸润一致，表明纯合 F/F 突变小鼠肝脏中存在促炎环境。用识别巨噬细胞标记物 Cd68 的抗体进行免疫组织化学染色，也检测到 F/F 突变小鼠肝脏中巨噬细胞数量增加。此外，在 MASH 模型和其他慢性疾病环境中被报道为脂质相关巨噬细胞群体标记物的几个基因，包括 Trem2 和 Spp1，在 F/F 肝脏中表达增加，而枯否细胞标记物如 Clec4f 的表达则降低。在纯合 F/F 突变小鼠中检测到的枯否细胞标记物减少，得到了先前研究的支持，这些研究将 LXRα 确定为这种细胞类型的谱系决定因子，这表明固醇依赖性信号传导对于该功能是必需的。当从富集的肝脏巨噬细胞群体中分离 RNA 时，也观察到了类似的基因表达差异。巨噬细胞基因表达的变化表明，LXR 信号通路对于肝脏髓样细胞群体的正确分化和功能是必需的。巨噬细胞通过吞噬全身的死亡和濒死细胞，需要对细胞内胆固醇水平的大幅增加做出反应。研究人员观察到纯合 F/F 小鼠脾脏显著增大，通过油红 O 染色与巨噬细胞标记物 Cd68 的共定位确定，其特征是出现了富含脂质的巨噬细胞。因此，W441F 小鼠揭示了 LXRs 对胆固醇的感应在肝脏和脾脏巨噬细胞群体中的重要作用。
MASH 表型的快速发展
在正常小鼠饮食条件下，杂合 F/F 突变小鼠肝脏表现出许多与 MASH 相关的表型，包括脂质负载的肝细胞、免疫细胞浸润和促纤维化基因表达（如 Spp1、Col1a1、Tgfb1）。然而，未检测到细胞外基质沉积和纤维化的组织学证据。为了研究在促进 MASH 的条件下 LXR 信号通路的需求，研究人员给 11 周龄的 W441F 小鼠喂食促进 MASH 的饮食（21% 脂肪、1.25% 胆固醇、34% 蔗糖）2 周。在这个时间点处死每种基因型的代表性小鼠，而其余动物继续喂食该饮食，并再用载体或 LXR 激动剂 T0901317 处理 2 周以重新激活 LXR 信号通路（总共暴露于饮食 4 周）。在喂食 2 周后，通过苦味酸天狼星红染色检测到杂合和纯合 W441F 小鼠均有胶原蛋白沉积，并且在载体处理的小鼠中，4 周时胶原蛋白沉积进一步增加。由于大多数依赖高脂肪 / 高胆固醇饮食的 MASH 模型需要几个月才能发展出组织学上可检测到的纤维化，W441F 小鼠中纤维化的快速发展表明 LXR 活性在调节这一过程中起着关键作用。值得注意的是，在用 T0901317 重新激活 LXR 信号通路后，胶原蛋白染色减少，与载体处理的动物相比，其水平类似于 2 周时测量的水平。通过血浆 ALT 和 AST 活性量化的肝损伤也遵循类似的趋势，并且在重新激活 LXR 活性后也显著降低。值得注意的是，杂合 W/F 突变小鼠的肝酶恢复正常。
对喂食 MASH 饮食的小鼠肝脏切片进行油红 O 染色，显示出 W441F 小鼠与对照组相比独特的脂质积累模式。正如在喂食高脂肪饮食的小鼠肝脏中通常观察到的那样，对照 W/W 小鼠具有相对较小且染色强烈的脂滴，在 2 - 4 周内脂滴大小增加。此外，用已知促进脂肪酸合成的 LXR 激动剂 T0901317 处理对照小鼠，会增加脂滴的大小。相比之下，杂合和纯合 W441F 小鼠的肝细胞表现出弥漫性脂质染色。W441F 小鼠中脂质负载的细胞似乎与 H&E 染色肝脏切片中检测到的大的气球样变肝细胞相关，研究人员认为这些细胞主要充满胆固醇。与这一假设一致，在喂食 2 周和 4 周后，W441F 小鼠的肝脏胆固醇升高，而肝脏甘油三酯与 W/W 对照组相比降低。用 T0901317 处理重新激活 LXR 信号通路，可降低杂合 W/F 突变小鼠的肝脏胆固醇，但对纯合 F/F 小鼠的肝脏胆固醇没有显著影响。由于 W441F 小鼠的肝脏存在纤维化，难以提取胆固醇，特别是在 F/F 样本中，胆固醇含量和重新激活 LXR 的效果可能被低估。在喂食 MASH 饮食 2 周和 4 周后，W441F 小鼠的肝脏和脾脏重量也显著增加，用 T0901317 处理重新激活 LXR 信号通路，要么完全（W/F 杂合子）要么部分（F/F 纯合子）挽救了这些表型。用 T0901317 处理的 W/W 对照小鼠肝脏重量增加，这与之前关于该化合物促进高脂肪喂养小鼠肝肿大的报道一致。最后，W441F 突变小鼠在 MASH 饮食中体重不增，且脂肪量减少。这种生长不良似乎是肝损伤的继发效应，在用 T0901317 处理的动物中得到逆转。
TAZ 是一种转录共激活因子，在人类 MASH 患者和小鼠模型中均过表达。最近的研究表明，TAZ 通过肝脏胆固醇升高而稳定，并促进纤维化和炎症。研究人员在喂食 MASH 饮食的雌性对照、杂合或纯合 W441F 小鼠肝脏中未检测到 TAZ 蛋白水平的差异。相比之下，在雄性 W441F 小鼠肝脏中，TAZ 水平在喂食 MASH 饮食后增加。有趣的是，先前探索 TAZ 对小鼠 MASH 发展贡献的研究仅检查了雄性动物。用 T0901317 处理雄性小鼠 2 周，会增加对照 W/W 小鼠肝脏中 TAZ 的含量。然而，这些动物没有炎症或纤维化的组织学证据。因此，在 W441F 模型中，至少在暴露于 MASH 饮食 4 周后，增加 TAZ 不足以促进 MASH 的发展。
在喂食 MASH 饮食 2 周后，W/F 杂合子肝脏现在在表型上与 F/F 纯合子肝脏相似，表现为肝脏胆固醇升高、免疫细胞浸润和胶原蛋白沉积。基因表达的变化是饮食对杂合 W/F 表型影响的另一种表现。在喂食 MASH 饮食 4 周后，肝脏 RNA-Seq 数据的 PCA 分析表明，载体处理的 W/F 杂合子小鼠肝脏基因表达现在与 F/F 纯合子中观察到的表达模式非常相似，W/F 和 F/F 肝脏中分别有 4030 和 5095 个基因表达失调。基因本体分析确定了许多在正常饮食的 F/F 小鼠中也观察到的失调途径，包括脂质代谢、炎症和细胞粘附 / 细胞外基质，然而在
