克隆气道基底祖细胞通过再上皮化修复纤维化肺

　　

克隆气道基底祖细胞通过再上皮化修复纤维化肺组织

摘要：特发性肺纤维化（IPF）患者肺上皮的不可逆损伤在全球范围内导致高死亡率，目前尚无有效的肺修复方法。在此研究中，同济大学附属东方医院再生医学研究所等单位的研究人员发现，在小鼠和猴子模型中，气道基底层的 KRT5+ P63 + 祖细胞在纤维化损伤后可进入肺泡区域。借助自动化培养系统，研究人员从 44 名患有不同肺部疾病的供体中克隆并鉴定了气道基底祖细胞。将人类祖细胞移植到小鼠肺部后，能够有效地使受损的肺泡区域重新上皮化，形成新的呼吸道和囊状结构，从而改善纤维化病变并提高小鼠的存活率。从机制上讲，植入的人类祖细胞并非通过分化为小鼠肺部的成熟肺泡细胞发挥作用；相反，它们分化为表达多种紧密连接蛋白（如 CLDN4）的囊状细胞，有助于肺重新建立上皮屏障。此外，通过克隆大型哺乳动物和鸟类的 P63 + 气道基底祖细胞，研究人员构建了多种肺嵌合动物，并揭示了这些祖细胞在肺修复中进化上保守的作用。总体而言，该研究数据突出了气道基底祖细胞在纤维化肺中的命运，并为缺乏固有恢复机制的肺部疾病提供了一种潜在的治疗策略。

一、研究背景

肺上皮暴露于大气中，对于协调对感染性生物、毒素和过敏刺激的初始反应至关重要，最重要的是维持正常的气体交换功能。为了支持高效的气体交换，肺必须在大气和充满液体的组织之间维持上皮屏障，以避免细胞或组织渗入肺泡区域。IPF 是一种严重的呼吸系统疾病，其特征是肺气体交换功能进行性下降，患者通常在确诊后 3 - 5 年内死亡。IPF 患者的肺部通常表现为肺泡上皮缺失，伴有肺泡结构塌陷。这种上皮完整性的丧失导致 IPF 患者无法用新分化的上皮细胞有效封闭损伤部位，从而损害了有效物理屏障的维持。相反，这些结构会被过度增殖的成纤维细胞和炎症细胞取代，最终导致严重后果。因此，目前上皮修复过程被认为是 IPF 的核心事件，然而，针对成纤维细胞的传统抗纤维化药物（如吡非尼酮或尼达尼布）几乎无法挽救这一过程。这促使人们开发旨在恢复 IPF 肺气体交换功能的新治疗策略。

干细胞 / 祖细胞在重建缺失的肺上皮和恢复肺功能方面具有巨大潜力。肺上皮损伤后，气道和肺泡中的各种上皮干细胞和祖细胞可被激活以启动组织修复。其中，一群位于气道上皮基底层、表达 P63 和 KRT5 基因的干细胞 / 祖细胞受到了广泛研究。在支气管中，P63+ KRT5 + 气道基底祖细胞负责气道上皮的稳态维持和再生。有趣的是，在严重肺损伤时，气道中的这些祖细胞可被动员并迁移到更远端的肺泡区域。它们在肺泡区域的确切行为和功能存在较大争议。一些研究认为，肺泡区域的气道基底祖细胞具有再生 II 型和 I 型肺泡上皮的潜力，有助于肺修复过程；而近年来，另一些研究则认为，肺泡区域的这些气道基底祖细胞倾向于在肺泡腔内形成发育异常的结构，如 “基底样”、细支气管化或蜂窝状囊肿结构，这会损害肺修复过程，甚至直接驱动纤维化进程。此外，不同物种（如小鼠和人类）的气道基底祖细胞在解剖学和功能上可能存在差异。在本研究中，研究人员试图系统评估人类气道基底祖细胞在肺泡区域的功能，并将其与其他动物物种的祖细胞进行比较，以探索基于气道基底祖细胞移植的潜在治疗方法。

二、研究结果

2.1 损伤小鼠和非人灵长类动物肺中气道基底祖细胞的激活

首先，研究人员在动物模型中研究了 P63+ KRT5 + 气道基底祖细胞。在小鼠肺部，经促纤维化药物博来霉素诱导损伤后，研究人员观察到肺泡区域持续存在 Krt5 + 细胞，这与先前的报道一致。为了确认肺泡腔内的某些 Krt5 + 细胞是否来源于驻留的基底细胞，研究人员利用了 Krt5 (ROSA) 26Sortm4 (ACTB-tdTomato-EGFP) 小鼠品系，通过在博来霉素诱导损伤前给予他莫昔芬，可对气道基底细胞进行有效的谱系标记。损伤后 30 天，研究人员观察到 GFP + 细胞分布在气道上皮中。研究人员还观察到具有薄而扁平形态的 GFP + 细胞排列在肺泡区域，但这些细胞不表达已知的肺泡细胞标记物。尽管肺泡腔内 GFP + 细胞的数量相对较少，但这些数据表明，至少部分预先存在的气道基底祖细胞在肺纤维化损伤后可被激活并进入肺泡区域。这一发现与流感模型中的观察结果不同，且与先前的报道一致，即小鼠 Krt5 + 细胞无法有效地再生成熟的肺泡上皮细胞。这也表明，其他 Krt5?细胞群体在肺损伤后可能产生 Krt5 + 细胞。

为了研究小鼠中的这一观察结果与高等动物的相关性，研究人员使用食蟹猴作为肺纤维化的研究模型。非人灵长类动物的肺结构与人类几乎相同。与小鼠不同，猴子和人类的气道基底祖细胞分布在整个主要气道，直至远端呼吸性细支气管，但在健康猴子的肺泡区域不存在。通过将博来霉素直接注入猴子肺部，研究人员在注射后 71 天通过 CT 成像观察到猴子肺部出现广泛的损伤和纤维化，并通过组织学染色证实。与小鼠类似，研究人员观察到受损猴子肺部肺泡区域的气道基底祖细胞扩增。利用先前建立的祖细胞克隆方法，研究人员从受损猴子肺部分离出 P63+ KRT5 + 祖细胞克隆，其数量约为对照肺部的 6 倍。总之，这些数据证实，在小鼠和灵长类动物中，肺损伤后，位于气道的一些内源性气道基底祖细胞可被激活并迁移到肺泡区域。

2.2 从患者肺部相对健康区域克隆气道基底祖细胞

接下来，为了研究人类的气道基底祖细胞，研究人员按照先前的报道，从健康供体和患有各种肺部疾病的患者中克隆祖细胞。对于这些患者，为了获得受疾病影响较小的祖细胞，研究人员从肺部相对健康区域的 3 - 5 级气道收集组织，并进行祖细胞培养。为了避免从 IPF 患者中采集病理组织，研究人员仅在通过 CT 成像确定为放射学健康的上叶气道进行支气管镜刷检采样，并在支气管镜下直接观察确认。从支气管镜刷检样本中克隆的气道基底祖细胞形成表达 P63 和 KRT5 的集落。对慢性阻塞性肺疾病（COPD）和非囊性纤维化支气管扩张患者采用了类似的采样和细胞克隆策略。从不同供体克隆的细胞总体上表现出相似的形态。为了最小化手动细胞培养相关的批次效应并提高工作效率，研究人员开发了一种自动化细胞克隆系统。该系统利用 6 轴机械臂模拟手动操作细胞。验证数据表明，使用该机器人系统培养的气道基底祖细胞与初级操作人员培养的细胞质量相当。

研究人员总共从 44 名供体中克隆了气道基底祖细胞，包括 6 名健康供体和 12 名 IPF 患者、13 名 COPD 患者以及 13 名支气管扩张患者，用于转录组分析。患者的人口统计学信息简要列于补充表 1 中。对整个转录组进行无监督主成分分析（PCA）显示，总体而言，健康供体与 COPD 患者（P 值 = 0.11）、IPF 患者（P 值 = 0.16）或支气管扩张患者（P 值 = 0.33）之间在统计学上没有显著差异。然而，研究人员在供体之间观察到了很大的异质性。尽管大多数患者克隆的转录组谱与健康对照相似，但约 25% 的患者克隆表现出明显差异，特别是 4 个 IPF 克隆和 4 个 COPD 克隆，这与先前关于患者变异克隆的报道一致。此外，当将所有患者汇总进行分析时，研究人员观察到细胞的 P63 表达水平与患者的第 1 秒用力呼气量（FEV1）呈显著负相关，这表明人类气道的阻塞或炎症可能会上调气道基底祖细胞中 P63 基因的表达，与先前在小鼠中的观察结果一致。研究人员未观察到 P63 水平与肺一氧化碳弥散量（DLCO）之间存在显著相关性，这表明患者肺部的肺泡损伤对气道中的气道基底祖细胞直接影响较小。

研究人员还注意到，与健康供体相比，COPD 祖细胞克隆中与可的松反应相关的基因表达较高。这一观察结果可能归因于 COPD 患者通常接受的长期吸入可的松治疗，导致祖细胞的基因表达谱发生改变。值得注意的是，COPD 克隆中未表现出已知的促炎变异细胞特征基因（如 CXCL 家族趋化因子、白细胞介素和干扰素）的高表达，这与其来源于肺部相对健康区域一致。在 IPF 患者中，祖细胞克隆表现出参与抗菌反应的基因高表达，这可能与 IPF 患者中频繁的上呼吸道感染有关。重要的是，这些从健康上叶克隆的 IPF 细胞未表现出先前报道的促纤维化变异细胞特征基因的高表达，表明它们不太可能是致病的，而可能是相对正常的。

2.3 植入细胞生成囊状结构

为了描绘人类气道基底祖细胞在肺泡区域的行为，研究人员将 GFP 标记的人类气道基底祖细胞移植到经博来霉素诱导损伤的免疫缺陷小鼠肺部。与先前的气管内递送方法不同，研究人员对小鼠采用注射器通气，以确保祖细胞有效地分布到远端气道。随后，研究人员通过使用特异性识别人类抗原的抗体进行免疫染色，确认了植入小鼠肺泡区域的人类细胞的身份。用 GFP 表达慢病毒标记的移植细胞在移植后 8 天和 35 天的组织学切片免疫染色中均可检测到。重要的是，这些植入细胞仅定位在肺的受损或修复肺叶中，在健康肺叶中未观察到。研究人员还证实，如果将细胞移植到健康小鼠肺部，则不会检测到植入。

移植后 8 天，植入细胞在肺泡区域大规模植入。这些细胞大多呈立方形形态，形成类似 “豆荚” 的结构。这些豆荚状排列与在纤维化小鼠肺部观察到的内源性 Krt5 + 豆荚以及 IPF 患者肺部的 KRT5 + 豆荚非常相似。移植后 35 天，植入细胞发生显著转变，呈扁平形态，并在肺泡区域组织成类似 “囊泡” 的腺泡结构。值得注意的是，这些囊状结构呈现单层形态，与先前描述的以双层立方形或柱状细胞为特征的 “细支气管化” 结构不同。囊泡的平均线性截距（MLI）为 92.55μm（四分位距：76.92，108.1），比人类肺泡（平均：193.40，四分位距：162.4，232.5）小，但比小鼠肺泡（平均：59.14，四分位距：53.57，64.56）大。此外，囊泡壁的中位最小厚度为 10.83μm（四分位距：8.91，14.22）。这一测量值与人类肺泡的厚度（中位数 8.29，四分位距：7.28，12.47）非常接近，且超过了小鼠肺泡的厚度（中位数：5.16，四分位距：4.23，6.25）。

为了了解植入细胞的空间分布，研究人员对小鼠肺部进行了三维（3D）可视化。研究人员发现，人类细胞产生的豆荚和囊泡主要与小鼠支气管相连，形成从主支气管发出的新呼吸道。移植后 8 天，大多数豆荚分布在主支气管周围 500μm 范围内。到移植后 35 天，500μm 半径内的大多数结构已转变为囊泡，且豆荚延伸到更远的区域（距主支气管 500 - 2000μm）。这些发现支持了一个工作模型，即 “豆荚到囊泡” 的转变以从近端到远端气道的定向方式发生，未分化的气道基底祖细胞持续存在于迁移尖端。有趣的是，这种细胞形态变化的近端 - 远端梯度模式可能与胎儿肺发育过程中观察到的囊泡形成发育过程密切相似，这表明再上皮化过程在一定程度上重现了肺发育过程。

2.4 移植后气道基底祖细胞的屏障功能分析

为了进一步研究囊泡结构的特征和潜在功能，研究人员对移植后 35 天的肺切片进行了高分辨率空间转录组分析。免疫组织化学（IHC）染色证实了植入细胞形成的人类豆荚和囊泡的位置，这通过对人类参考基因组数量计数的测序分析得到了证实。空间转录组分析显示，与豆荚区域相比，囊泡区域的基因表达模式明显不同。豆荚区域的 P63 和 KRT5 基因表达水平远高于囊泡区域。相反，囊泡区域的紧密连接基因 CLDN4 表达水平较高。先前的研究表明，在人类肺部，CLDN4 在 I 型肺泡上皮细胞（AEC1）和 II 型肺泡上皮细胞（AEC2）中均高度表达，其过表达可增强肺泡上皮屏障功能，并有助于清除肺泡液。同时，囊泡区域还高表达其他紧密连接基因，包括 CLDN3、CLDN7、ZO - 2 和 JAM，这些基因可促进紧密连接复合物的组装。囊泡区域还高表达水通道基因 AQP5，其可调节液体稳态，因此与囊泡区域的紧密连接蛋白一起形成完整的屏障。

接下来，研究人员研究了植入的人类细胞是否有助于受损小鼠肺功能的恢复。首先，研究人员评估了小鼠肺的上皮完整性。对上皮细胞标记物 CDH1（E - 钙粘蛋白）和 CLDN4 的分析表明，纤维化蜂窝状区域缺乏上皮，尤其是缺乏紧密连接基因表达的上皮。相比之下，人类气道基底祖细胞的移植有效地使囊泡区域的肺重新上皮化，形成 CLDN4 + 上皮细胞。此外，人类囊泡区域的小鼠成纤维细胞标记物（Col1a1 和 Fn1）或免疫细胞标记物（Cd45 和 Cd11b）表达水平极低。与囊泡区域相比，一些人类豆荚区域仍表达高水平的小鼠成纤维细胞基因，与受损区域相似。这些观察结果通过组织学分析得到了进一步证实。有趣的是，与蜂窝状区域相比，在人类囊泡区域检测到小鼠 II 型肺泡细胞标记物 SPC 的表达水平显著更高。在人类囊泡区域还观察到小鼠肺泡毛细血管标记基因 Car4 的大量表达，这与血管标记物 CD31 和 CD34 的免疫染色数据一致。这些数据表明，植入的人类气道基底祖细胞能够有效地使小鼠肺泡区域重新上皮化。

研究人员还使用 Transwell 实验在体外研究了人类气道基底祖细胞的屏障功能。将祖细胞在孔的半透膜上培养成单层，直至达到 100% 汇合。然后应用跨上皮电阻（TEER）技术测量屏障完整性。数据显示，人类气道基底祖细胞的 TEER 值约为 360Ω/cm2，是人类肺泡上皮癌细胞系 A549 的 5 倍。在另一项 Transwell 实验中，研究人员将人类成纤维细胞 MRC5 应用于上腔的上皮细胞单层，并在 24 小时后计数迁移到下腔的成纤维细胞数量。结果表明，与 A549 单层细胞相比，祖细胞单层几乎完全阻止了成纤维细胞向下腔的侵袭。总之，上述发现表明，气道基底祖细胞建立的上皮屏障具有强大的功能，可阻止纤维化的进展。

为了确定气道基底祖细胞移植的再上皮化是否对小鼠肺有益，研究人员在移植后 3 周分析了小鼠肺的纤维化状态。数据显示，细胞移植显著减少了肺的炎症面积和肺纤维化水平。尽管小鼠的肺功能分析表明，小鼠的肺活量、吸气量或用力呼气量没有显著改善，但小鼠动脉血气分析显示，与安慰剂对照组相比，氧分压 / 二氧化碳分压比值在统计学上有显著增加。生存曲线分析表明，细胞移植有效地避免了接受致死剂量博来霉素损伤的小鼠死亡。总之，这些发现表明，气道基底祖细胞对裸露或纤维化肺组织的再上皮化可作为一种 “急救” 解决方案，促进肺的恢复过程。

2.5 通过单细胞转录组分析对植入的人类气道基底祖细胞进行命运图谱分析

为了深入了解人类气道基底祖细胞在肺中的命运特化过程，研究人员使用流式细胞术在不同时间点对植入的 GFP + 细胞进行分选，随后进行 10x Genomics 单细胞 RNA 测序分析。对细胞进行无监督聚类，鉴定出 7 个不同的细胞群体。移植后 8 天，肺中的主要人类细胞群体包括静止的 KRT5+ P63 + 气道基底祖细胞、增殖的 KRT5+ P63 + 气道基底祖细胞和 KRT5+ P63?细胞。到移植后 35 天，静止的 KRT5+ P63 + 气道基底祖细胞比例保持稳定，但增殖的 KRT5+ P63 + 气道基底祖细胞比例急剧下降，仅占总细胞的 1.77%。移植后 35 天，SCGB1A1 + 人类分泌细胞数量略有增加，免疫染色证实其存在于小鼠细支气管中。此外，在测序数据中检测到一群人类纤毛细胞，免疫染色也证实了其在小鼠细支气管中的分布。与人类肺单细胞图谱相比，分化的分泌细胞与纤毛细胞的比例没有偏差，这是正常气道基底祖细胞的特征。

与上述空间转录组数据一致，存在一大群表达紧密连接基因 CLDN4 的细胞，在移植后 8 天至 35 天期间，该细胞群体始终是最丰富的人类细胞群体。免疫染色证实了 CLDN4 蛋白在形成囊状结构的植入人类细胞中的表达。这群 CLDN4 + 细胞还高表达其他紧密连接基因，如 JAM 和 CLDN7，但不表达 CLDN3。有趣的是，这群 CLDN4+