人调节性T细胞单细胞抑制谱

　　

人类调节性 T 细胞的单细胞抑制分析

摘要

调节性 T 细胞（Treg）在维持健康和疾病状态下的免疫稳态中发挥着重要作用。传统上，对其抑制功能的检测是通过混合纯化的细胞群体进行的，这无法准确反映生理相关的反应。为克服这一局限性，日本大阪大学传染病教育与研究中心（CiDER）人类免疫学团队的研究人员开发了 “人类 Tregs 单细胞抑制分析技术（scSPOT）” 。scSPOT 利用包含 52 种标记物的细胞飞行时间质谱（CyTOF）检测板、细胞分裂检测算法以及全外周血单个核细胞（PBMC）系统，可同时评估 Tregs 对所有其他细胞类型的影响。在这项直接对比研究中，研究人员发现 Tregs 通过部分阻断细胞分裂、抑制细胞周期以及下调效应分子，对效应记忆 CD8 T 细胞具有最为显著的抑制作用。此外，scSPOT 还识别出了此前在病毒感染中观察到的 Treg 表型差异，并揭示了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物伊匹木单抗（Ipilimumab）和他泽司他（Tazemetostat）的作用模式。scSPOT 具有可扩展性、稳定性和广泛适用性，有助于深入理解 Treg 免疫生物学机制，并可用于筛选治疗性化合物。

一、引言

自 1995 年调节性 T 细胞（Treg）首次被描述以来，该领域迅速发展。Tregs 在自身免疫性疾病、癌症和移植等多种情况下发挥着关键作用。为更好地理解 Treg 介导的免疫抑制机制及其临床意义，人们开发了多种 Treg 抑制检测方法。1998 年，日本大阪大学传染病教育与研究中心（CiDER）人类免疫学团队的研究人员及其他学者最初描述的 Treg 抑制检测方法采用放射测量法来测量总增殖情况。随后，诸如羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）等分裂追踪染料以及额外激活标记物的加入，虽提高了该方法的实用性，但它仍局限于对少数纯化细胞群体进行比较。

Tregs 可分为多个亚群，主要包括初始 Tregs（nTreg）和效应 Tregs（eTreg）。nTregs 起源于胸腺，以静息状态循环，可通过 CD45RA 的表达以及关键调节分子如细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4（CTLA4）和叉头框蛋白 P3（Foxp3）的低水平表达来识别。在遇到外周的抗原刺激和适当的细胞因子信号后，nTregs 会被激活并分化为 eTregs。eTregs 通过一系列机制发挥抑制功能，包括 CTLA4、白细胞介素 10（IL10）和 CD39 等。从初始状态到效应状态的动态转变使 Tregs 能够适应并应对不断变化的免疫环境，维持免疫稳态。滤泡调节性 T 细胞（Tfr）通过表面标记物 CXCR5 的表达与其他 Treg 亚群区分开来，在抑制过度的 B 细胞反应和调节抗体产生方面发挥重要作用。由于不同的 Treg 亚群会影响不同的细胞类型，因此直接比较 Treg 亚群对复杂免疫细胞混合物的影响非常重要，但此前这一目标难以实现。

两种获得 FDA 批准的 Treg 调节药物是抗 CTLA4 检查点抑制剂伊匹木单抗和组蛋白甲基化抑制剂他泽司他。CTLA4 是 T 细胞激活的关键负调节因子，它能够去除抗原呈递细胞（APC）上的共刺激分子 CD80/CD86，从而阻止常规 T 细胞上的 CD28 与 APC 上的 CD80/CD86 之间的共刺激相互作用，同时使程序性死亡配体 1（PD-L1）从与 CD80 的顺式相互作用中释放出来，进而通过程序性死亡受体 1（PD1）抑制 T 细胞的激活和增殖。用伊匹木单抗等抗体阻断 CTLA4 可增强 T 细胞的激活和增殖，这可能是由于 Tregs 的抑制活性降低，其机制包括 Fc 依赖的 Treg 耗竭、对 CTLA4 功能的拮抗阻断或 Treg 的不稳定。

他泽司他的作用靶点 EZH2 对 Tregs 的抑制功能至关重要。EZH2 是多梳抑制复合物 2 的一部分，通过甲基转移酶活性介导组蛋白 H3 赖氨酸 27 的三甲基化（H3K27me3），这是一种抑制性的组蛋白标记。在临床上，他泽司他在 Treg 功能失调导致免疫逃逸的癌症（如某些淋巴瘤和肉瘤）治疗中显示出潜力。尽管基因敲除模型和药物抑制实验已证明 EZH2 在 Treg 的分化和激活中发挥重要作用，但 EZH2 抑制影响 Tregs 的精确机制尚未阐明。

在此，日本大阪大学传染病教育与研究中心（CiDER）人类免疫学团队的研究人员证明，应用单细胞蛋白质组学技术可改进 Treg 抑制检测方法，从而在全 PBMC 系统中从单细胞水平全面研究 Treg 介导的对不同免疫细胞亚群的抑制作用。由于该检测方法能够追踪单个 Treg 亚群，因此也有助于深入了解这些细胞在不同条件下的命运和功能。研究人员进一步展示了该方法在药物筛选方面的适用性，并利用它揭示了 FDA 批准的药物伊匹木单抗和他泽司他在人类 Tregs 中的新作用模式。该检测方法有助于更好地理解 Treg 的抑制功能，并用于筛选治疗性化合物。

二、研究结果

2.1 scSPOT 同时筛选 Treg 对所有免疫亚群的抑制作用

人类 Tregs 单细胞抑制分析技术（scSPOT）基于改变全 PBMCs 中 Tregs 的数量，并通过包含 52 种标记物的 CyTOF 检测板进行检测。该检测板结合了质谱流式细胞术的最新进展，能够同时检测所有免疫亚群的抑制、激活、代谢、组蛋白甲基化、细胞周期、分裂追踪以及从头大分子生物合成情况（图 1a、b）。研究人员使用高维聚类和标准标记物来识别细胞类型，首先区分不同的细胞谱系，然后使用如 CCR7、CD45RA、CXCR3、CXCR5 和 Foxp3 等标记物，将每个谱系进一步细分为相关的亚群，以区分初始、中央记忆（CM）和效应记忆（EM）CD8 T 细胞，以及 CD4 T 细胞亚群，如 Th1、Tfh 和 Tregs（图 S1 - S5a、图 1c）。通过比较不存在 Tregs 和存在效应（e）Tregs 的两种条件，研究人员观察到，在没有 Tregs 时，效应细胞类型（CD8EM、浆母细胞（B - plasma）、Th1、CD8 - CM、活化 B 细胞（B - activated）、髓样 DRhi 细胞）数量增加（图 1d、e）。相反，添加 eTregs 导致初始细胞（CD4 和 CD8 T 细胞）、Tfh 细胞以及代谢组低表达细胞（由代谢标记物细胞色素 C、氨基酸转运体 CD98 的低表达以及通过嘌呤霉素摄取测量的从头蛋白质合成低水平来定义）富集（图 1d、e、S5b、S1）。大多数差异表达的标记物与细胞增殖相关（CFSE、Ki67，图 1f）。然而，CD8 - EM 上的效应分子如颗粒酶 B（GzmB）、髓样细胞上的 PD - L1 和 CD86，以及 Tfh、Th17 和 CD8 - EM 细胞上的 CD38，会因 eTregs 的存在而受到抑制（图 1f）。此外，在活化 B 细胞和浆母细胞上，CXCR3 的表达下调，最近它被确定为干扰素 - γ 诱导的浆母细胞的标记物。相反，添加 eTregs 后，CD8 初始细胞和 B 初始细胞中的从头 RNA 产生（BrU）增加，活化 B 细胞中的组蛋白修饰 H3K27me3 增加（图 1f）。由于细胞在培养前用 CFSE 染色（图 1a），研究人员还可以分析每种免疫细胞类型的增殖情况（图 1g、S6）。通过比较各分裂阶段的频率、分裂百分比和分裂指数，研究人员发现大多数效应细胞类型（CD8 - EM、CD8 - CM、B - activated）在添加 eTregs 后，部分停滞在未分裂阶段（图 1h）。与此一致的是，在后期分裂阶段发现的这些效应细胞类型较少。由于浆母细胞在健康 PBMC 中非常罕见，大多数浆母细胞可能在培养过程中以增殖依赖的方式形成，导致 CFSE 信号较低。因此，浆母细胞的主要差异出现在第 4 次分裂。与浆母细胞类似，单个亚谱系群体可能在培养过程中从其他细胞类型分化而来，这增加了结果解释的复杂性。如果需要，研究人员可以通过不将每个谱系细分为多个群体，而是在更高层次上进行分析，来简化读数（图 S5c）。

总之，scSPOT 能够同时精细剖析 Treg 介导的对所有免疫细胞的抑制作用。在这项直接对比研究中，研究人员观察到，与其他效应细胞类型相比，eTregs 对 CD8 - EM 的抑制作用最为明显（在细胞类型（图 1e）、标记物（图 1g）以及图 1h 中使用的两种增殖测量指标方面，变化倍数最为显著且一致）。因此，研究人员决定进一步研究每个细胞分裂阶段中受抑制的 CD8 - EM 细胞（图 2）。

2.2 CD8 T 细胞的单细胞分裂分析

为了探究 CD8 - EM 细胞的每个分裂阶段，研究人员开发了一种新算法，以可扩展的方式将每种细胞类型分类到不同的分裂次数（图 S6）。通过使用单细胞分裂分析（scDP）算法，研究人员可以将 CD8 T 细胞（图 2a）分为未分裂（div0）、分裂一次（div1）、分裂两次（div2）等（图 2b）。正如预期的那样，细胞分裂情况（图 2c）与 CFSE 染色结果（图 2d）呈镜像关系，并且在很大程度上与 Ki67 表达（图 2e）相当。仅使用 CD8 - EM 细胞也获得了类似的结果（图 2f - h）。与先前发表的手动或半自动设门方法不同，scDP 算法能够以前所未有的规模进行细胞分裂追踪。通过使用 scDP 对细胞分裂进行分类，研究人员可以看到 CD8EM 细胞的分裂增加如何在统一流形近似和投影（UMAP）图上从右向左移动（图 2i），从而实现对数据的高维探索。通过将每个分裂阶段与未分裂的 CD8 - EM 细胞进行比较，研究人员发现，在没有 Tregs 存在时，代谢标记物（OPA1、葡萄糖转运蛋白 1（GLUT1））以及 CD25、CXCR3 和 CD38 迅速上调。GzmB 在分裂一次后也略有上调，并在随后的每次分裂中进一步增加。相反，添加 eTregs 后，所有这些标记物的表达水平均受到抑制，而 CD27 的表达仍然较高（图 2k）。有趣的是，抑制性标记物如 T 细胞免疫球蛋白和 ITIM 结构域（TIGIT）和 CTLA4 在有 Tregs 存在的情况下，在 CD8 - EM 增殖的后期分裂阶段增加。此外，使用 Ki67、5 - 碘 - 2' - 脱氧尿苷（IdU）和细胞周期蛋白 B1（CyclinB1）对细胞周期阶段进行设门（图 2l）显示，eTregs 抑制 CD8 - EM 细胞从 G0 期的非分裂细胞转变为 G1 期和 S 期（图 2m）。对每个分裂阶段的细胞周期进行进一步剖析发现，在早期分裂阶段（div1），eTregs 抑制 CD8 - EM 细胞从 G0 期的非分裂细胞转变为 G1 期，而在后期分裂阶段（div2），eTregs 抑制细胞通过 S 期（图 2n）。总体而言，研究人员发现 eTregs 对 CD8 - EM 的最大影响是阻止细胞分裂的起始，并使已分裂的细胞退出细胞周期。然而，对 Treg 抑制的精细剖析表明，即使是逃避增殖停滞的 CD8 细胞，在多个层面也存在功能受损。

2.3 CTLA4 阻断抑制人类 eTregs 的增殖

虽然 Treg 抑制检测通常侧重于对反应细胞的影响，但研究人员也利用他们的检测方法和 scDP 算法来研究增殖的 eTregs（图 3a - d）。在分裂的 eTregs 中，研究人员观察到比 CD8 - EM 更多的代谢标记物迅速上调（CD98、OPA1、GLUT1、电压依赖性阴离子通道 1（VDAC1））。在后期分裂阶段，营养转运蛋白 CD98（氨基酸）和 GLUT1（葡萄糖）以及从头蛋白质合成（嘌呤霉素（Puro））仍然是上调最明显的标记物之一（图 3d、S7a）。其他知名的 Treg 标记物，如 Foxp3 和 CTLA4，在分裂过程中也进一步上调（图 3d）。由于 CTLA4 阻断抗体是一种广泛用于临床癌症治疗的药物，研究人员试图在他们的系统中更详细地探索其作用。因此，研究人员用生物类似药伊匹木单抗处理他们的 scSPOT 系统，并通过 CTLA4 染色的减少同时测量该药物对所有免疫细胞的阻断效果。虽然在 Th17 和 Th2 细胞中可以看到一些细微差异，但阻断 CTLA4 的最大影响在于 eTregs 本身（图 3e）。这在阻断后的细胞比例中也很明显，eTregs 的减少最为显著，部分原因是增殖受到抑制（图 3f - h、S7b - d）。尽管差异不显著（p - adj < 0.06），但 CD8 - EM 和髓样 DRhi 细胞的增殖明显受到影响，不过与 eTregs 不同，研究人员无法确定它们的细胞状态存在与增殖无关的变化。对细胞周期阶段进行设门（图 3l）显示，用抗 CTLA4 处理后，eTregs 从 G0 期的非分裂细胞转变为 G1 期的过程显著受阻，这证实了 Th17 细胞在 CTLA4 阻断后有所增加（图 3f、g）。在标记物水平上，eTregs 也受到最显著的影响（图 3i、S7e）。增殖标记物（CFSE、Ki67）受影响最大，其次是氨基酸转运体 CD98 和从头蛋白质合成（Puro）（图 3i - k）。有趣的是，CTLA4 阻断并不影响凋亡标记物裂解的半胱天冬酶 3（cCasp3），这表明这是一种部分的增殖停滞，而非细胞死亡（图 3k）。在图 3i 中可以看到 CTLA4 表达和染色的明显变化。在 Th2 和 Th17 细胞中，CTLA4 阻断的影响比在 eTregs 中更具可变性，但对 Th2 细胞的增殖（图 3h）或细胞周期（图 S7g）没有明显影响，不过在 Th17 细胞中可以观察到 PD1 和 CD27 表达的一些较小变化（图 3m、S7f）。逃脱 CTLA4 介导的增殖阻断的 eTregs，与同型对照处理的 Tregs 相同分裂阶段相比，CD38、CCR7 和 CXCR3 表达增加，HLA - DR、CD98 和从头蛋白质合成（Puro）表达降低（图 3n）。

2.4 nTreg 来源的 eTregs 与循环 eTregs 存在差异

接下来，研究人员试图使用 scSPOT 探索 Treg 亚群（eTreg、初始 Treg（nTreg）和滤泡调节性 T 细胞（Tfr））抑制能力的差异（图 4a - e、S8a - c）。为此，研究人员从相同的供体中分选 Treg 亚群，以便能够直接比较它们的作用。无论添加哪种 Treg 亚群到培养物中，受影响的细胞类型大多相同（图 4c - e）。然而，频率变化的程度有所不同，eTregs 的抑制能力略强于 Tfr（如火山图上更高的变化倍数所示，图 4c - e）。与不添加 Treg 的条件相比，添加所有 Treg 亚群培养 5 天后，总细胞数（不包括 Tregs）显著降低（图 S8d、e），但 Treg 亚群之间受影响细胞类型的最显著相对差异是 eTreg 处理后代谢组低表达细胞的比例较高（图 1e、图 4c）。三种 Treg 亚群对每种细胞类型影响最大的标记物相似（图 S8a - c）。研究人员发现，CD8 - EM、CD8 - CM 和活化 B 细胞上的 CFSE（三种 Treg 亚群处理后均上调），以及活化 B 细胞上的 Ki67（三种 Treg 亚群处理后均下调）。然而，在标记物水平上，Treg 亚群之间也存在一些差异。例如，nTregs 影响 Th2 细胞上的许多标记物（如 CFSE、Ki67、TCF1、GLUT1），eTregs 特异性影响浆母细胞上的标记物（嘌呤霉素摄取和 CXCR3），而髓样 HLA - DRmi 细胞上的 CD86 仅在 eTregs 和 Tfr 处理后下调，nTregs 处理后则无此变化（图 S8a - c）。此外，研究人员注意到 Tfh 细胞上的 CXCR5 在每个细胞分裂阶段都下降（图 S8f），这表明高度分裂的 Tfh 细胞可能难以基于 CXCR5 进行识别。

为了确定代谢组低表达细胞的表型，研究人员将其标记物与 PBMC 中的所有其他细胞类型进行比较（图 S8g）。这些细胞除了许多代谢标记物水平较低外，凋亡标记物 cCasp3 也略有增加。基于谱系标记物的重新聚类显示，它们在表型上是谱系阴性、CD4 + T 细胞、CD19 + B 细胞和少数 CD8 + T 细胞的混合体（图 S8h、i）。研究人员将代谢组低表达细胞的这种分类纳入 eTregs 的差异丰度分析，