丰富的生姜化合物呋喃二烯酮通过外源核受体PXR减轻小鼠肠道炎症

　　

在众多天然产物中发现的类药分子价值已被大量文献记载。尽管许多膳食和草药疗法已被证实对治疗肠道炎症有效，但其活性成分的鉴定却相对滞后。在本研究中，研究人员发现生姜的一种主要成分呋喃二烯酮（FDN）是一种选择性孕烷 X 受体（PXR）配体，具有激动转录效应。研究显示，FDN 结合在 PXR 配体结合域（LBD）的一个亚口袋内，随后会改变 LBD 的结构。通过雄性小鼠实验，研究人员发现口服 FDN 具有强大的、依赖 PXR 的抗炎效果，且这种效果具有结肠特异性。在协同作用的激动剂存在时，FDN 亲和力增强且靶基因激活，这表明提升 FDN 的活性、功效和安全性还有进一步的研究空间。总体而言，这些结果支持 FDN 作为治疗和预防结肠疾病的治疗剂的转化潜力。

克罗恩病和溃疡性结肠炎在全球范围内影响着数百万患者，目前中国和美国的病例数最多。由于工业化进程和饮食结构的改变，这些疾病的病例数仍在上升，并且随着欠发达国家经济的发展和西方生活方式的普及，预计病例数将更为迅速地增加。尤其值得注意的是，亚洲、拉丁美洲和非洲的人口密集地区，炎症性肠病（IBD）患者数量预计将呈指数级增长。

截至 2021 年，克罗恩病和溃疡性结肠炎的直接治疗成本分别约为每位患者每年 12000 美元和 9000 美元。此外，IBD 患者常伴有肠外并发症，严重影响其生活质量，还会带来难以估量的额外费用。因此，预计在未来 30 年，IBD 将给全球带来沉重且不断增加的负担。

众多研究已证实 IBD 的发病机制、环境因素和肠道微生物群之间存在关联。IBD 的发病和流行与异常且持续的 T 细胞介导的免疫反应相关。不出所料，IBD 风险基因主要与多种免疫功能相关，这些免疫功能包括维持肠道物理屏障和自噬等先天性免疫过程。因此，目前大多数针对 IBD 的治疗干预措施主要旨在抑制炎症，通常是通过靶向特定的炎症分子来实现。然而，现有疗法仅对部分患者有效。此外，长期的免疫抑制治疗会带来感染和肿瘤相关的并发症。鉴于 IBD 还与上皮损伤和菌群失调有关，会导致肠道黏膜屏障功能失调，因此，在不单纯依赖免疫抑制的情况下促进黏膜愈合，是开发新型、安全的 IBD 治疗方法的关键策略。

尽管对 IBD 的发病机制以及药物治疗的疗效和副作用已有丰富的认识，但针对补充和整合医学对 IBD 治疗或治愈作用的研究却较为有限。姜科植物是世界上消费最多的膳食调味品之一，其药用历史超过 5000 年，可用于治疗流感、恶心、关节炎、偏头痛和高血压等疾病。临床试验和体内研究也探讨了补充生姜、生姜提取物和生姜衍生纳米颗粒对溃疡性结肠炎患者的治疗效果，如缓解腹泻和相关疼痛，以及减轻硫酸葡聚糖钠（DSS）等物质诱导的溃疡性结肠炎的严重程度。药物研究还聚焦于生姜的特定成分，表明姜辣素对结肠癌具有抑制作用。尽管有这些发现，但目前的证据表明，单独食用生姜提取物的效果与其潜在作用相比相对较弱。研究人员对其成分和作用机制缺乏全面了解，限制了其潜在的应用价值。

核受体（NRs）是许多膳食成分和营养素的通用传感器。因此，NRs 在维持肠道内稳态中发挥关键作用也就不足为奇了，它们通过响应适当的信号并调节肠道屏障完整性、转运体和局部炎症反应来实现这一功能。对 IBD 患者活检样本的分析以及动物研究结果表明，NR 生物学与 IBD 发病机制密切相关。特别是法尼醇 X 受体（FXR）、孕烷 X 受体（PXR）、过氧化物酶体增殖物激活受体 α 和 γ（PPARα 和 γ）、肝受体同源物 1（LRH - 1）和 V - erbA 相关蛋白 2（EAR2）等 NRs，均已被证实可调节肠道上皮细胞的完整性，并调节肠道免疫细胞的数量和活性。

在此，研究人员利用基于核受体的亲和纯化 - 非靶向质谱（APUMS）技术，以及质谱引导的天然产物发现方法，证实生姜化合物 5E，9E - 呋喃二烯酮（FDN）是一种高选择性的 PXR 激动剂。晶体学分析显示，FDN 占据了 PXR 的配体结合口袋（LBP），但留下了先前发现的一些较大配体使用的亚口袋位点（由 H3、H11 和 H12 螺旋界定）未被占据。进一步分析表明，FDN 和结合在相邻口袋的类固醇可协同结合 PXR，从而增强其功效和效力。也就是说，单独口服 FDN 能够显著减轻小鼠的全身炎症和结肠炎，且对其他组织没有有害影响，这表明 FDN 在 IBD 治疗方面具有潜在的应用价值。

结果

亲和下拉实验鉴定 FDN 为潜在的人源 PXR 或 CAR 配体

为了研究 NRs 在人类结肠组织中的表达程度，研究人员分析了来自基因型 - 组织表达（GTEx）数据库的 373 个乙状结肠样本和 406 个横结肠样本的转录组数据。数据表明，大多数 NRs 在这些结肠区域均有表达，但通常在神经元和视网膜组织中表达的（Nr1f2、Nr2e1 和 Nr2e3）以及主要存在于激素产生组织中的（Nr0b1 和 Nr5a1）除外（图 1a，b）。尽管一些检测到的 NRs 表达水平较低，但它们在 IBD 发病机制和治疗中的作用已得到充分证实，并且意义重大。因此，为了鉴定所有潜在 NR 靶标的配体，研究人员采用了一种活性代谢组学方法，使用带有 His 标签的 NR 配体结合域（LBDs），对除 NR0B1 和 NR0B2 以外的所有 NRs 进行研究，因为 NR0B1 和 NR0B2 在大肠杆菌中表达时溶解性和稳定性较差。

由于部分 NR LBDs 的溶解性存在挑战，研究人员采用了一种策略来模拟共激活因子对结构的稳定作用。这包括将一个 18 个氨基酸的类固醇受体共激活因子 - 1（SRC1）LxxLL 肽基序连接到有问题的 LBD C 末端。另一种方法是与维甲酸 X 受体（RXR）LBD 共表达，RXR LBD 可与部分 NRs 形成异二聚体，此前已被用于辅助结晶研究。LBD 序列是根据蛋白质数据库（PDB）中的报道选择的。随后表达、亲和纯化了 46 种 LBD 融合构建体（详见补充表 1），并通过质谱或蛋白质免疫印迹进行了验证。

由于许多已知的 NR 配体可从商业渠道获取，研究人员使用现有配体和 APUMS 技术，对部分相应的 LBD 融合构建体的活性进行了测试。接下来，这些融合蛋白被用于测试与生姜（Zingiber officinale）提取物中存在的次生代谢物的潜在相互作用。将提取物混合物加入含有 His 标签的 NR LBD 融合蛋白的大肠杆菌裂解物中。经过孵育和镍亲和纯化后，通过非靶向液相色谱 - 质谱（LC - MS）对样品进行分析，以鉴定被 NR 下拉富集的物质质量。使用未添加提取物的 NR LBD 融合蛋白进行对照下拉实验。通过排除大多数其他 NRs 下拉的质量，进一步减少了非特异性和低亲和力的相互作用。

在测试的 46 种 NRs 中，只有 PXR（NR1I2）、CAR（NR1I3）、RXRβ（NR2B2）和 RXRγ（NR2B3）从测试的生姜提取物中产生了明显且特异性富集的质量特征（图 1c - f）。使用正离子电喷雾电离（ESI +）模式的 LC - MS，有四个质量特征（m/z = 231.1372 和 232.1406；412.2678 和 413.2712）被 PXR（p = 0.022，富集 25772 倍；p = 0.013，富集 4219 倍；p = 0.002，富集 5096 倍；p = 0.0002，富集 1358 倍，图 1c）和 CAR（p = 0.009，富集 25267 倍；p = 0.011，富集 4432 倍；p = 0.0004，富集 97755 倍；p = 0.0007，富集 22864 倍，图 1d）同时下拉。前两个质量随后被确定为离子 [C??H??O?]?的同位素峰（Δm = - 5.6 ppm），另外两个被确定为离子 [C??H??O? + NH?]?的同位素峰（Δm = - 5.6 ppm）。两个质量特征（m/z = 345.2052 和 346.2086）被 RXRβ（p = 1.48e - 07，富集 18505 倍；p = 1.72821e - 05，富集 4750 倍，图 1e）和 RXRγ（p = 0.02268，富集 16545 倍；p = 0.036739，富集 3009 倍，图 1f）同时下拉。这两个质量随后被确定为离子 [C??H??O?Na]?的同位素峰（Δm = 3.0 ppm）。每个 NR 选择的富集特征总结在图 1g 中。

为了阐明鉴定出的物质的结构，研究人员将 15 kg 干姜根磨成粉末，用 95% 乙醇进行提取，然后使用正相和反相液相色谱进行分离。利用核磁共振（NMR）和 X 射线衍射（补充图 1），确定 m/z 为 231.1372 的化合物 1 为（5E，9E） - 3,6,10 - 三甲基 - 8,11 - 二氢 - 7H - 环癸 [b] 呋喃 - 4 - 酮（FDN，图 1h）。在分离过程中，m/z 为 412.2678 的化合物 2 发生脱羧反应（减少 44 道尔顿），其副产物被鉴定为 10 - 姜辣素。m/z 为 345.2052 的化合物 3 被鉴定为 8 - 姜辣素。

FDN 对 NR 转录活性的选择性影响

为了进一步评估 FDN 的特异性，研究人员使用全面的 FACTORIAL NR 检测系统，对 FDN 与所有 48 种人类 NRs 的结合情况进行了检测。当 FDN 浓度为 1 μM 时，PXR 是唯一有响应的 NR（图 2a）。在更高剂量下，雌激素受体 α 和 β（ERα 和 ERβ）以及 PPARγ 也观察到了激动效应（图 2a）。尽管 FDN 在 hCAR 的下拉实验中出现，但未检测到对 hCAR 的激动反应（图 2a）。为了进一步评估 FDN 对 PXR 和 CAR 相对转录活性的影响，研究人员利用了一种基于 HeLa 细胞的稳定细胞系（HG5LN），该细胞系表达与 GAL4 DNA 结合域（DBD）融合的 hPXR 或 hCAR LBDs，以及 UAS - 荧光素酶报告基因。hPXR 的实验结果与下拉实验一致，其 EC??值为 2.8 μM，约为 SR12813 完全激动剂活性的 80%（图 2b）。对于 hCAR，FDN 仅表现出微弱的激动活性，且由于在较高浓度下可能存在细胞毒性，无法达到饱和状态，因此无法确定其 EC??值（图 2c）。综上所述，FDN 与 CAR 的相互作用似乎较弱且无效。

为了在后续动物研究中评估 FDN 对 ERα、ERβ 和 PPARγ 的潜在脱靶效应，研究人员利用了 HELN - hERα、HELN - hERβ 和 HG5LN - PPARγ 荧光素酶报告基因细胞系来确定其功效。与 FACTORIAL NR 检测结果一致，FDN 需要相对较高的浓度才能激活这些受体，且激活作用较弱（ERα、ERβ 和 PPARγ 分别约为 15%、30% 和 18%，与对照激动剂活性相比，图 2d）。这或许可以解释之前关于 FDN 抑制 17β - 雌二醇（E2）刺激的 ERα 信号传导的发现，即高浓度下 FDN 作为竞争性部分激动剂发挥作用。

配体 - 受体相互作用的进一步表征

作为确定 FDN、hPXR 和 hCAR 之间相互作用的生化性质的第一步，研究人员使用了等温滴定量热法（ITC）。用 His 标签的 hPXR - LBD - SRC1 融合蛋白滴定 FDN 溶液，产生了放热结合反应（图 2e，上图）。相比之下，用 hCAR LBD 滴定 FDN 未显示出任何显著的相互作用（补充图 2）。将总热变化与增加的 PXR - LBD - SRC1 蛋白浓度进行绘图分析，结果表明结合化学计量比约为 1:1（配体：蛋白质，mol/mol，图 2e，下图）。曲线拟合分析得出解离常数为 4.5 μM。正的吉布斯自由能（ΔG）值（ - 7.28 ± 0.40 kcal/mol，图 2f）表明配体结合是自发的。FDN 结合还产生了有利的焓（ΔH）值（ - 2.40 ± 2.45 kcal/mol，图 2f），同时伴随着显著的熵损失（ΔS）（16.38 ± 8.60 cal/mol/deg，图 2f），这表明 LBD 构象自由度降低。

FDN - PXR 相互作用的结构分析

为了从结构角度更深入地了解 FDN 的作用模式，研究人员解析了结合态 PXR LBD（以下简称 PXR）的晶体结构，分辨率为 1.95 ?（补充表 2）。该结构显示出典型的 PXR 活性构象，C 末端螺旋 H12（也称为 AF - 2 或激活螺旋 - 2）覆盖在 LBP 上，FDN 通过电子密度定位在 LBP 内（图 2g）。值得注意的是，与周围残基相比，FDN 的电子密度相当弥散，这表明其结合模式具有动态性。尽管如此，用 Phenix（Adams，Acta Cryst D，2010）计算的 polder 省略图显示出不受配体模型影响的电子密度，因为在计算该图时已将配体模型从结构中移除（补充图 4）。该图表示一个体积，在其中可以令人信服地插入 FDN 模型，且不存在其他取向。

与 FDN 对 PXR 的中等亲和力（EC?? = 2.77 μM）一致，FDN 是一种相对较小的化合物，它与 PXR LBP 中的 8 个残基相互作用（距离截止值为 4.2 ?，图 2h 和补充图 4）。相比之下，强效 PXR 激动剂和抗癌药物达拉非尼（DAB）占据了更大的体积，并且与 LBP 残基有更多的接触（图 2i），这与其对受体的更高亲和力（EC?? = 87 nM）相符。FDN 的两个主要锚定点包括：（1）其十元环与所谓的 PXR π - 陷阱（由氨基酸 F288、W299 和 Y306 组成）之间的多个接触；（2）FDN 的羰基部分与 Q285 之间可能形成的氢键（图 2h）。此外，FDN 的呋喃环与 M243、M246、S247 和 F288 有若干相互作用（图 2h）。

FDN 缓解 DSS 诱导的结肠炎

鉴于生姜在传统医学中广泛用于治疗肠道炎症，且 PXR 在 IBD 中的作用已为人所知，研究人员接下来利用 DSS 诱导的结肠炎小鼠模型，测试了 FDN 缓解肠道炎症的潜力。DSS 给药会破坏结肠上皮细胞屏障的完整性，使细菌更容易穿透，进而引发炎症和损伤。在开始这项研究之前，研究人员测试了 FDN 是否能够激活小鼠 PXR（mPXR），因为许多 hPXR 激动剂并不能激活 mPXR。研究人员使用表达 mPXR LBD - GAL4 融合蛋白以及 UAS - 荧光素酶报告基因的 HEK293 细胞系，发现 FDN 确实能够激活 mPXR，其功效与对 hPXR 的激活效果相似（EC?? = 4.9 μM，补充图 5）。

在 DSS 研究中，小鼠接受 FDN 或先前已验证和测试的 mPXR 激动剂孕烯醇酮 16α - 腈（PCN）治疗，两者的浓度均相对较低，为 10 mg/kg。为了降低实验成本和复杂性，这些研究仅使用雄性小鼠。两种化合物都提供了相似的保护作用，包括降低疾病活动指数评分（图 3a）、减轻体重减轻（图 3b）和减少结肠缩短（图 3c，d）。用苏木精和伊红（H&E）染色的结肠切片的组织学分析也显示，接受激动剂治疗的小鼠组织损伤减少（图 3e，f）。

PXR 介导的结肠保护机制

为了验证观察到的 FDN 对肠道的保护作用是否依赖于 PXR，研究人员进行了额外的实验，以探讨 FDN 的作用机制和 PXR 的依赖性。研究人员首先观察了三个已知的 PXR 靶基因。研究人员注意到，FDN 和阳性对照 PCN 均上调了典型 PXR 靶基因 Cyp3a11 的表达，Cyp3a11 有助于异生物质的代谢和消除；同时也上调了 Mdr