细胞内UDP-GlcNAc保留和o - glcna酰化对骨关节炎衰老相关分泌表型的调节

　　

在翻译中，保留了专业术语的英文缩写，如 OA（骨关节炎）、UDP - GlcNAc（尿苷二磷酸 N - 乙酰葡糖胺）、O - GlcNAcylation（O - 糖基化）等，以符合学术规范，且确保专业术语翻译前后一致。同时，按照要求用 “第一作者单位的研究人员” 代替第一人称进行表述。

骨关节炎中胞质 UDP - GlcNAc 滞留和 O - GlcNAcylation 对衰老相关分泌表型的调控
第一作者单位的研究人员发现，UDP - GlcNAc 作为软骨蛋白聚糖中糖胺聚糖（GAG）链的构建模块，同时也是 O - GlcNAcylation 的底物。在骨关节炎（OA）中，OA 是导致残疾的主要原因，给社会经济带来了沉重负担，影响着全球 7% 的人口。OA 的进展以软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜炎症等病理变化为特征。

关节暴露于 OA 的危险因素会逐渐积累衰老细胞，主要存在于关节软骨的表层。衰老的软骨细胞会增强衰老相关分泌表型（SASP），其包含炎症介质和基质降解酶，从而导致关节的低度慢性炎症。因此，调节 SASP 产生的 senostatics 被认为是治疗 OA 的合理策略。

OA 软骨退变主要涉及软骨基质中蛋白聚糖（PGs）的流失。由于 UDP - GlcNAc 是 GAG 链重复二糖单元的构建模块，软骨细胞需要充分维持细胞内的 UDP - GlcNAc 水平。UDP - GlcNAc 还作为 O - 连接 - N - 乙酰葡糖胺化（O - GlcNAcylation）的底物，O - GlcNAc 转移酶（OGT）催化 UDP - GlcNAc 上的 GlcNAc 添加到靶蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上，而 O - GlcNAcase（OGA）则去除这种翻译后修饰。O - GlcNAcylation 是一种关键的翻译后修饰，它将营养和代谢感知与多种细胞反应的调节联系起来，其失调与多种人类疾病相关。

第一作者单位的研究人员在观察到衰老表型发展过程中，可能影响 UDP - GlcNAc 细胞内分布的转运蛋白表达发生显著变化后，开展了本研究，旨在探索 UDP - GlcNAc 区室化的变化如何影响 O - GlcNAcylation 和细胞衰老的关键特征。研究表明，UDP - GlcNAc 区室化是控制 O - GlcNAcylation 的一种独特方式，它引导软骨细胞分泌途径从 PG 合成转向衰老相关的慢性炎症，为开发 senostatics 治疗 OA 提供了有价值的见解。

结果

1. 衰老的软骨细胞表现出细胞内 UDP - GlcNAc 通量的改变：UDP - GlcNAc 和 UDP - N - 乙酰半乳糖胺（UDP - GalNAc）可相互转化，它们由一系列溶质载体家族 35（SLC35）转运蛋白从细胞质转运到内质网（ER）和高尔基体。由于 OA 的主要特征是软骨中 PG 含量的减少，第一作者单位的研究人员通过基因表达综合数据库（GEO）研究了这些转运蛋白在 OA 或 OA 相关转录组数据中的表达情况。结果显示，在多个人类 OA 转录组数据集中，UDP - GlcNAc 和 UDP - GalNAc 转运蛋白的表达均下调，在白细胞介素（IL） - 1β 处理的软骨细胞和各种 OA 动物模型中也是如此。

衰老的软骨细胞与 OA 的发展有关。DNA 损伤化学试剂（如阿霉素或博来霉素）和电离辐射（IR）可诱导人 C28/I2 软骨细胞和原代培养的小鼠软骨细胞发生细胞衰老，表现为衰老相关 β - 半乳糖苷酶（SA - β - Gal）阳性增加、S 期进入减少、CDKN1A 和 CDKN2A INK4A 表达上调以及 LMNB1 表达下调。主成分分析（PCA）显示，博来霉素和阿霉素处理后的软骨细胞转录组存在明显差异。值得注意的是，衰老诱导刺激通常会降低这些细胞中 SLC35A3、SLC35B4、SLC35D1 和 SLC35D2 的表达水平。

第一作者单位的研究人员随后测量了软骨细胞中 ER、高尔基体和细胞质中 UDP - GlcNAc 的含量，发现衰老诱导刺激会降低 ER 和高尔基体中的 UDP - GlcNAc 水平，同时增加其在细胞质中的含量，而总 UDP - GlcNAc 水平不受影响。抑制己糖胺生物合成途径会同时降低 ER、高尔基体和细胞质中的 UDP - GlcNAc 水平。这些结果表明，衰老诱导刺激通过优先将 UDP - GlcNAc 保留在细胞质中，改变了其细胞内分布，且这种重新分布与衰老软骨细胞分泌的 PGs 中 GAG 含量的减少相关。此外，在 OA 软骨或衰老软骨细胞中，OGT 和 OGA 的表达没有统计学显著变化。
2. O - GlcNAcylation 与 OA 软骨中的软骨细胞衰老相关：由于细胞质中的 UDP - GlcNAc 是 O - GlcNAcylation 的底物，第一作者单位的研究人员探究了 OA 受累软骨中细胞内 UDP - GlcNAc 通量的改变是否与 O - GlcNAcylation 程度相关。结果发现，OA 受累的人软骨中 O - GlcNAcylation 程度显著升高，且细胞衰老的生物标志物 p16INK4a 的表达与 O - GlcNAcylation 信号高度共定位。

考虑到衰老软骨细胞中 UDP - GlcNAc 的细胞质积累，研究人员进一步研究了衰老诱导刺激对原代培养的人和小鼠软骨细胞中 O - GlcNAcylation 的影响。结果显示，阿霉素处理后人关节软骨细胞的 O - GlcNAcylation 水平显著增加，博来霉素处理或长期暴露于过氧化氢（H?O?）后，原代小鼠软骨细胞的 O - GlcNAcylation 也普遍增加。

研究人员还探讨了 O - GlcNAcylation 是否是软骨细胞进入衰老所必需的。然而，博来霉素诱导的 DNA 损伤和 SA - β - Gal 阳性增加并未被 OGT 抑制剂 ST045849 缓解，衰老细胞永久细胞周期停滞相关的生物标志物 Cdkn1a 和 Cdkn2a Ink4a 的表达也不受 O - GlcNAcylation 的影响。这表明 O - GlcNAcylation 不影响软骨细胞进入衰老，因此研究人员接着探究其对 SASP 发展的影响。

损伤诱导的人关节软骨细胞衰老导致 SASP 因子表达，同时 GATA4（一种调控 SASP 的转录调节因子）表达上调。在 OA 受累的人软骨中，GATA4 和 SASP 因子的表达水平明显高于未受损的软骨，且 GATA4 表达与 O - GlcNAcylation 信号高度共定位。抑制 O - GlcNAcylation 可有效抑制衰老软骨细胞中 SASP 因子的表达，而增强 O - GlcNAcylation 则会进一步提高 SASP 的表达。基因集富集分析（GSEA）显示，抑制 O - GlcNAcylation 会使衰老软骨细胞转录组中 “细胞外基质降解” 和 “炎症反应中细胞因子产生的正调控” 等基因集呈负富集。这些结果表明，应激诱导的 O - GlcNAcylation 是衰老软骨细胞中 SASP 充分展示所必需的。
3. GATA4 的 O - GlcNAcylation 调节其稳定性和转录活性：鉴于 OA 软骨中 O - GlcNAcylation 程度与 SASP 调节因子 GATA4 表达之间的相关性，第一作者单位的研究人员探索了 O - GlcNAcylation 与 GATA4 调节之间可能的机制联系。细胞共免疫沉淀实验表明 GATA4 与 OGT 相互作用，且 GATA4 可被 O - GlcNAcylation 修饰。

进一步研究发现，O - GlcNAcylation 的增加显著促进了 GATA4 的蛋白水平，进而增强了 GATA4 介导的转录活性，而抑制 O - GlcNAcylation 则导致 GATA4 介导的转录活性下调。环己酰亚胺（CHX）追踪实验表明，增加 O - GlcNAcylation 程度可显著增强 GATA4 蛋白的稳定性。此外，OGT 抑制剂 ST045849 处理会抑制 GATA4 靶基因的表达，且在 Gata4 沉默后，ST045849 对博来霉素诱导的 SASP 因子表达没有额外的抑制作用。这些结果表明，O - GlcNAcylation 通过 GATA4 途径调节 SASP 的表达。

通过质谱（MS） - 基于的蛋白质组学分析，研究人员确定了 GATA4 上的两个 O - GlcNAcylation 位点：S212 和 S406。构建 GATA4 突变体研究发现，GATA4 - S406A 突变体对 thiamet - G 处理无反应，表明 GATA4 在 S406 的 O - GlcNAcylation 在保护其免受自噬介导的降解中起作用。进一步研究发现，thiamet - G 处理会显著减少 GATA4 与 p62 的结合，而 GATA4 - S406A 与 p62 的结合不受 thiamet - G 处理的影响。总之，应激诱导的 O - GlcNAcylation 通过阻止 GATA4 与 p62 结合，从而稳定 GATA4，防止其进入溶酶体降解途径。
4. 软骨表层 GATA4 的基因缺失改善小鼠 OA：为了更好地了解该机制在生理环境中的相关性，第一作者单位的研究人员检测了创伤后 OA 小鼠模型膝关节软骨中 O - GlcNAcylation 和 GATA4 的表达模式，发现它们的免疫组化信号局限于关节软骨的表层，且模式高度重叠。

由于 GATA4 在 OA 发病机制中对软骨细胞的作用尚未明确，研究人员构建了他莫昔芬（TMX）诱导的软骨细胞特异性 Gata4 敲除小鼠，并通过手术诱导创伤后 OA。结果显示，Gata4 敲除显著改善了 OA 的表现，包括软骨破坏、软骨下骨硬化、骨赘成熟和滑膜炎，同时减轻了 OA 相关疼痛。

基于这些结果，研究人员假设，如果 Gata4 敲除的保护作用是通过对衰老软骨细胞的 senostatic 作用实现的，那么在软骨表层局部敲除 Gata4 就足以对 OA 发展产生保护作用。为此，研究人员构建了 Gata4fl/fl; Prg4 - CreERT2 小鼠系，实现了在关节软骨表层特异性敲除 Gata4。结果发现，这种局部敲除 Gata4 显著减轻了 OA 软骨破坏、软骨下骨硬化、骨赘成熟和滑膜炎症，在分子水平上抑制了基质金属蛋白酶 3（MMP3）、MMP13 和 IL - 6 的表达，同时减轻了 OA 相关疼痛。
5. 在小鼠创伤后 OA 中对 O - GlcNAc - GATA4 轴的药物靶向治疗：第一作者单位的研究人员的发现表明，O - GlcNAcylation 促进 GATA4 的稳定性，从而促进软骨细胞中的 SASP，加重小鼠创伤后 OA。因此，研究人员探究了控制关节中 O - GlcNAcylation 程度是否会影响 OA 在体内的进展。

首先，研究人员研究了抑制 OGA 以增加 O - GlcNAcylation 对小鼠创伤后 OA 进展的影响。结果显示，关节内（IA）注射 thiamet - G 会导致 OA 表型提前出现，包括软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘成熟和滑膜炎，同时加重 OA 相关疼痛。

相反，用 OGT 抑制剂 ST045849 处理后，衰老软骨细胞的转录组中 “OA 患者中上调的基因” 呈负富集。为了测试其治疗 OA 的潜在效果，研究人员将 ST045849 负载于可注射水凝胶系统中，进行关节内注射。结果显示，该治疗有效减轻了 OA 软骨破坏，降低了 GATA4 表达和胶原及 PG 的不可逆损伤，同时抑制了衰老标记物和 SASP 的表达，显著抑制了其他 OA 关节表现和疼痛的发展。
6. 过量补充葡萄糖胺会加重小鼠创伤后 OA：葡萄糖胺作为 UDP - GlcNAc 的前体，常被 OA 患者和老年人作为补充剂服用，期望维持 PG 含量。葡萄糖胺可绕过己糖胺生物合成途径的限速步骤，加快 UDP - GlcNAc 的产生，可能促进细胞 O - GlcNAc 修饰。

第一作者单位的研究人员发现，硫酸葡萄糖胺处理显著提高了整体 O - GlcNAcylation 水平，增强了 GATA4 蛋白的稳定性。在 DMM 诱导的创伤后 OA 小鼠模型中，过量补充葡萄糖胺对假手术小鼠无明显影响，但在 DMM 手术小鼠中，会显著加重 OA 发展，包括加剧软骨破坏和骨重塑，同时增加 GATA4 和 OA 相关分解代谢分泌因子的水平，加重 OA 相关疼痛。

讨论

软骨细胞衰老在 OA 发病机制中导致软骨基质分解代谢和慢性关节炎症，主要由 SASP 介导。Senolytics 可去除衰老软骨细胞，但可能对软骨组织的结构支持产生不利影响。Senostatics 作为调节 SASP 的策略，被认为是治疗 OA 的合理方法。

GATA4 是一种关键的转录调节因子，控制与衰老相关的应激诱导促炎分泌程序。在 OA 中，GATA4 主要在关节软骨表层的软骨细胞中表达，特异性敲除表层软骨细胞中的 GATA4 可消除 SASP 并延缓 OA 发展。因此，了解 GATA4 稳定的调节机制对开发治疗 OA 的 senostatics 至关重要。

第一作者单位的研究人员揭示，O - GlcNAcylation 作为一种应激传感器，通过抑制 GATA4 的选择性自噬降解，触发软骨细胞的慢性炎症反应。具体而言，GATA4 在 S406 位点的 O - GlcNAcylation 会破坏其与 p62 的相互作用，导致 GATA4 积累，刺激 SASP 表达，促进慢性炎症。在人和小鼠 OA 软骨中，O - GlcNAcylation 和 GATA4 的表达模式高度重叠，支持了它们在生理环境中的关联。抑制 O - GlcNAcylation 可显著抑制 OA 进展。

UDP - GlcNAc 是己糖胺生物合成途径的终产物，葡萄糖胺可增强 UDP - GlcNAc 的产生和 O - GlcNAc 修饰。本研究表明，过量补充葡萄糖胺会加重小鼠创伤后 OA，提示关节不稳定的个体应谨慎考虑过量摄入葡萄糖胺。高血糖也与 UDP - GlcNAc 产生和 O - GlcNAc 修饰上调有关，这可能部分解释了 OA 与 2 型糖尿病之间的关联。因此，需要对葡萄糖胺补充和血糖水平对 OA 发病机制的影响进行全面的临床评估。

研究还发现，UDP - GlcNAc 的区室化是控制 O - GlcNAcylation 的关键机制。衰老软骨细胞中 UDP - GlcNAc 通量从分泌细胞器重新定向到细胞质，与软骨细胞分泌途径的病理转变密切相关。这一过程似乎由 SLC35 转运蛋白家族成员表达的集体减少所协调，其缺陷与哺乳动物软骨和骨骼发育受损有关。此外，衰老驱动的 miR - 204 上调导致 SLC35B4 和 SLC35D1 下调，与 OA 发展过程中 PG 合成减少有关。

本研究存在一些局限性。例如，在评估 GATA4 的位点特异性 O - GlcNAcylation 方面缺乏精确性，未来需要开发针对 O - GlcNAcylated GATA4 的特异性抗体。研究使用雄性小鼠和女性人类软骨样本，未来应评估研究结果在不同性别中的一致性。在治疗策略方面，应靶向 GATA4 特异性 O - GlcNAcylation，而不是全局 O - GlcNAcylation，以避免细胞毒性。此外，本研究中给小鼠喂食的葡萄糖胺剂量较高，未来应综合考虑多种因素评估其对 OA 进展的影响。

综上所述，第一作者单位的研究人员证明了 O - GlcNAcylation 在 OA 发展过程中对软骨细胞分泌程序的病理转变中起关键作用。应激诱导的 GATA4 的 O - GlcNAcylation 增强了衰老相关的慢性炎症和 OA 发病机制。因此，靶向应激诱导的 GATA4 的 O - GlcNAcylation 可能为管理 OA 中衰老相关的慢性炎症提供有前景的 senostatic 策略。