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为探究 I-E 型 CRISPR-Cas 系统中 Cas5-HNH/Cascade 复合物的作用机制，研究人员解析其 DNA 结合与未结合状态的近原子分辨率冷冻电镜结构。发现关键相互作用及二价离子对酶活性的影响，为研究该系统功能提供结构基础。
在微生物的世界里，一场看不见的战争每天都在上演。细菌等原核生物时刻面临着外来遗传物质，如噬菌体和质粒的入侵威胁。为了抵御这些 “敌人”，原核生物进化出了一套强大的防御武器 ——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas（CRISPR 相关蛋白）系统。
CRISPR-Cas 系统就像是原核生物的 “基因免疫系统”，其中 CRISPR 阵列由保守的重复序列和可变的间隔序列组成，这些间隔序列来源于外来核酸，是原核生物的 “免疫记忆”。转录产生的 CRISPR RNA（crRNA）会与 Cas 蛋白组装成大型核糖核蛋白监测复合物，识别并降解入侵的外源 DNA。根据组成和作用方式的不同，CRISPR-Cas 系统分为两大类、六种类型及众多亚型。其中，I 类系统较为常见，包含多个蛋白效应器；II 类系统则依赖单个效应蛋白，如在基因编辑技术中大放异彩的 Cas9。
在经典的 I-E 型 CRISPR-Cas 系统中，Cascade（CRISPR 相关抗病毒防御复合物）监测复合物由 Cas5、Cas6、Cas7、Cas8 和 Cas11 这五种蛋白按不同化学计量比组成。其免疫反应分为三个阶段：间隔序列获取、crRNA 加工和干扰。然而，以往研究的 Cas3 核酸酶在典型 I-E 系统中表现出渐进式 DNA 切割，而近期发现的含 HNH 核酸酶结构域的 Cascade 系统却能实现精确切割。但这一新型系统的作用机制却一直是个谜，为了解开这个谜团，来自中国科学院物理研究所、天津医科大学等研究机构的研究人员开展了深入研究。
研究人员通过解析 Ca. Cloacimonetes 细菌 Cas5-HNH/Cascade 复合物在 DNA 结合和未结合状态下的近原子分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构，发现了许多关键信息。在复合物的整体架构方面，其呈现独特的海马状结构，结合目标 DNA 后，会采取更紧凑的构象。HNH 结构域在复合物中发挥核酸酶的作用，它与经典 HNH 基序有所不同，关键保守残基的突变会完全消除切割活性。同时，HNH 结构域与相邻亚基（Cas6 和 Cas11）存在广泛相互作用，这些相互作用对复合物功能至关重要，相关突变会显著影响酶切效率。在 DNA 结合过程中，Cas5-HNH/Cascade 复合物各亚基发生显著运动，Cas6 和 Cas11 远离目标 DNA 的 5’端，打开切割活性通道，HNH 结构域则向底物移动。而且，该复合物对某些二价离子敏感，如锌、钴、镍等，这些离子会使 Cascade 复合物不稳定，下调酶活性。此外，研究还发现该复合物切割双链 DNA（dsDNA）时，先切割目标链，再切割非目标链，且对不同位置错配的耐受性不同。
为开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是蛋白表达与纯化技术，将相关 Cas 基因导入大肠杆菌进行表达，经过多步纯化获得目标蛋白复合物；其次是冷冻电镜技术，制备复合物的冷冻电镜样本并收集数据，从而解析其结构；还有体外 DNA 切割实验和电泳迁移率变动分析（EMSA），用于检测复合物的酶活性和 DNA 结合能力。
下面详细介绍研究结果：
- Cas5-HNH/Cascade 复合物的生化与结构测定：在大肠杆菌中重组表达野生型 Cas5-HNH/Cascade 复合物，SDS-PAGE 分析确认各亚基共纯化，消化实验验证其酶活性。通过冷冻电镜解析出目标游离复合物的三种构象、单链 DNA（ssDNA）结合复合物的两种构象以及双链 DNA 结合复合物的一种构象。
- Cas5-HNH/Cascade 复合物的整体架构：复合物呈海马状，结合 DNA 后构象更紧凑。六个 Cas7 亚基沿 crRNA 形成螺旋丝，是复合物的结构支架。crRNA 与多个亚基通过氢键和 π-π 相互作用广泛接触。结合目标 DNA 时，目标链 5’端发生 U 型转弯，侵入 HNH 结构域，非目标链部分密度因柔性未被观察到。
- HNH 结构域在 Cas5-HNH Cascade 中的功能：HNH 结构域中的关键保守残基（如 H310、D324）对切割活性至关重要，突变会使活性丧失，但不影响 DNA 结合。HNH 结构域与 Cas6、Cas11 存在广泛相互作用，相关突变会影响复合物功能。
- 比较结构揭示不同构象差异：结合 DNA 的复合物比未结合的构象更紧凑。结合单链或双链 DNA 时，Cas5、Cas8 和 Cas7.6 亚基以及 crRNA 会发生显著构象变化，且亚基向核酸酶中心移动激活酶。
- 二价离子对 Cas5-HNH/Cascade 复合物的调节作用：HNH 结构域中的四个保守半胱氨酸形成类似锌指的结构，突变会消除 DNA 结合和消化能力。不同金属离子对复合物酶活性影响不同，镁、锰、钙存在时酶活性相当，而铯、钴、镍、锌会降低酶活性，其中锌和钴几乎使酶活性丧失，且钴、镍、锌会导致复合物解离。
研究结论和讨论部分指出，该研究解析了 Cas5-HNH Cascade 复合物的近原子结构，揭示了 HNH 结构域取代经典 I-E 型系统中 Cas3 核酸酶的作用机制。明确了 HNH 结构域与相邻亚基相互作用、结合 DNA 后的构象变化以及二价离子对复合物的影响。这些发现为进一步研究这一新型 I-E 型 CRISPR-Cas 系统的分子和结构功能奠定了基础，有助于深入理解原核生物的免疫防御机制，也为相关基因编辑技术的开发和优化提供了重要的理论依据 。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为该领域的研究开辟了新的方向。
