自噬成分LC3通过LFA1转运响应外向内信号调节淋巴细胞粘附

　　

自噬成分 LC3 通过响应由外向内信号的 LFA1 转运调节淋巴细胞黏附

作者：Naoyuki Kondo、Yuko Mimori-Kiyosue、Keizo Tokuhiro、Giuseppe Pezzotti、Tatsuo Kinashi
发表期刊：Nature Communications
发表时间：2024 年 5 月 29 日 接收；2025 年 1 月 23 日 录用；2025 年 2 月 4 日 在线发表
研究机构：

1. 日本大阪关西医科大学医学生物科学研究所分子遗传学系
2. 日本大阪关西医科大学医学生物科学研究所基因组编辑系
3. 日本大阪关西医科大学 生物医学工程中心
   论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-56631-1

白细胞整合素 LFA1（αLβ2）在淋巴细胞归巢和黏附中起着基础性作用，这对于免疫监视至关重要。LFA1 的激活由双向信号传导控制，即由内向外信号传导和由外向内信号传导。由内向外信号传导由淋巴细胞中除整合素之外的表面分子（如 T 细胞受体（TCR）和趋化因子受体）触发，激活 Rap1，诱导 LFA1 从无活性的低亲和力 / 弯曲构象（图 1a 中的 “Low”）转变为有活性的高亲和力 / 开放构象（图 1a 中的 “High”）。由内向外信号传导驱动的 LFA1 构象变化导致 LFA1 与细胞间黏附分子 1（ICAM1）结合，这使 LFA1 稳定在其活性状态并诱导由外向内信号传导，从而导致细胞骨架重组和细胞铺展。小 GTP 酶 Rap1 结合三磷酸鸟苷（GTP），并通过暴露 C 末端的香叶基香叶基部分定位于膜上。结合 GTP 的活性 Rap1 在与效应分子（如 RAPL 和 RIAM）结合时，在整合素激活中起关键作用。Rap1 - RAPL 复合物激活 Ste20 样激酶 Mst1，Mst1 使 NDR1 激酶磷酸化；磷酸化的 NDR1 募集 LFA1 衔接蛋白 kindlin - 3，从而调节 LFA1 的活性。Rap1 还介导 LFA1 衔接蛋白 talin1 的募集，使其直接与 LFA1 结合。LFA1 的激活受亲和力（LFA1 - ICAM1 相互作用的持续时间取决于 LFA1 的构象）和亲和力（LFA1 - ICAM1 结合频率受细胞接触表面 LFA1 密度调节）的调节。近期研究表明，LFA1 向有活性的高亲和力形式（图 1a 中的 “High”）的构象变化由有效的由外向内信号传导介导，该信号传导激活 Rap1，导致 LFA1 在接触表面积累（亲和力增加），并募集 kindlin - 3 和 talin1 到接触表面以形成高亲和力的 LFA1（亲和力增加）。此外，研究还发现，在剪切流条件下 LFA1 亲和力的增加并非仅由由内向外信号传导诱导，而是涉及 ICAM1 和 talin1 同时与 LFA1 结合所产生的张力积累。因此，关西医科大学医学生物科学研究所分子遗传学系的研究人员阐明了由 talin1 和 kindlin - 3 介导的 LFA1 亲和力调节机制，然而，LFA1 积累的详细机制仍不清楚。

巨自噬（以下简称自噬）是一种关键的细胞存活机制，通过降解细胞器为细胞提供能量来源，使其免受营养耗尽的影响。它由营养缺乏导致的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制所诱导。随后的信号级联促进磷脂酰乙醇胺（PE）与微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3（LC3，一种形成自噬体的关键成分）的结合，自噬体是一种双膜囊泡结构，可吞噬细胞质成分。自噬体通过动力蛋白依赖的运输与溶酶体融合，导致货物降解。Wilkinson 等人报道，Mst1 对 LC3 苏氨酸 50（T50）的磷酸化通过促进动力蛋白依赖的逆行运输以及自噬体与溶酶体的融合来增强自噬。然而，LC3 在自噬调节之外的作用仍不清楚。

越来越多的证据表明 LC3 具有非经典作用。LC3 相关吞噬作用（LAP）在巨噬细胞中观察到，有助于宿主防御和抗原呈递，其功能独立于 mTOR 活性。同样，LC3 相关内吞作用（LANDO）在中枢神经系统细胞（如小胶质细胞）的神经炎症、受体回收和神经退行性变中发挥作用，其运作独立于 mTOR 途径和 AMP 激活蛋白激酶（AMPK）途径。虽然 LAP 和 LANDO 都参与调节蛋白质降解，但 LC3 在特定分子或因子的主动、极化运输中的作用尚未见报道。这凸显了进一步探索 LC3 非经典功能的必要性，特别是在蛋白质降解以外的过程中。

在本研究中，关西医科大学医学生物科学研究所分子遗传学系的研究人员阐明了一种通过由外向内信号从高亲和力 LFA1 诱导 LFA1 转运来调节淋巴细胞黏附的机制。研究人员揭示了 LC3 在自噬之外的一种未知功能，即连接了两个看似不相关的途径：LFA1 转运途径和自噬体转运途径。研究人员发现，由外向内信号诱导的 LFA1 簇与 LC3 簇共定位并共同转运，LC3 簇也是响应由外向内信号而形成的。LC3b 及其同源物 GABARAP 的缺失降低了淋巴细胞的黏附性，并减少了 LFA1 在细胞接触表面的聚集和积累，这表明 LC3 家族蛋白参与了整合素依赖的淋巴细胞黏附。研究人员使用自噬通量探针和针对经典自噬成分的抗体证明，由外向内信号不会诱导自噬通量，并且与经典自噬信号不同；由外向内信号激活 mTOR 和 AMPK，而在经典自噬途径中，营养饥饿抑制 mTOR 但激活 AMPK。有趣的是，AMPK 的激活促进了 LFA1 和 LC3 在接触表面的聚集和积累，从而增加了淋巴细胞的黏附性。ATG16L1 在经典和非经典自噬中对 LC3 脂化至关重要，它也调节 LFA1 和 LC3 的聚集以及黏附。使用 ATG16L1 功能域截断突变体的分析表明，LFA1 和 LC3 的聚集以及黏附依赖于由 ATG16L1 调节的经典和非经典脂化途径。LC3 直接与 RAPL 结合，抑制其被 Mst1 磷酸化。磷酸化残基 T50 的缺失增加了 LFA1 在接触表面的积累，并显著增强了淋巴细胞的黏附性。本研究突出了 LC3 功能的未知方面，并揭示了一种以前未被识别的 LFA1 在接触表面聚集和募集的途径，为淋巴细胞黏附性的调节提供了重要见解。

研究结果

LFA1 簇与自噬体成分 Rab7 和 LC3 共定位

此前，研究人员展示了在黏附的淋巴细胞中，LFA1 在细胞接触区域附近形成细胞内簇（ICC）。为了识别参与 LFA1 ICC 形成和转运调节的因素，研究人员将 LFA1 与针对囊泡转运调节剂的抗体共染色，并使用表达 SNAP 标签融合整合素 β2 的淋巴细胞，通过超分辨率显微镜观察 ICC（图 1a，补充图 1b）。LFA1 与反式高尔基体标记 TGN38、溶酶体标记 LAMP1、回收内体标记 Rab11、ESCRT - III / 多囊泡体成分 VPS4 以及先前已知的调节剂 Rab27 没有明显共定位。然而，LFA1 与 Rab7 和 LC3 共定位（图 1b，补充图 1c - e）。LFA1 ICCs 定位于 Rab7 和 LC3 阳性的亚细胞区域（补充图 1f），三维数据显示其与 LC3 共定位（补充图 2）。使用旋转盘显微镜同时监测 LFA1 和 LC3，发现 LFA1 与 LC3 共同转运（图 1c，d，补充视频 1）。对淋巴细胞进行 LC3 同源物 γ - 氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）染色，结果显示 GABARAP 与含有 LC3/LFA1 的簇共定位，这表明 LFA1 和 ATG8 家族蛋白（即 LC3 和 GABARAP）存在于类似的簇状隔室中（图 1e）。

为了进一步研究 LFA1 和 LC3 之间的关系，研究人员建立了 F?rster 共振能量转移（FRET）测定系统（补充图 3）。研究人员在淋巴细胞中表达了与黄色荧光蛋白 YPet 融合的 LC3b（YPet - LC3b）和与红色荧光蛋白 mCherry 融合的 β2（β2 - mCherry）。作为阳性对照，使用表达串联融合的 YPet - FL - mCherry（其经历分子内 FRET）的淋巴细胞，而表达单独的 YPet 和 β2 - mCherry 的细胞作为阴性对照。研究人员观察到，在表达 YPet - LC3 和 β2 - mCherry 的细胞中，从 YPet 到 mCherry 的 FRET 明显强于表达 YPet 和 β2 - mCherry 的细胞，这表明 LFA1 和 LC3 紧密相邻，从而允许 FRET 发生（图 1f）。

ATG8 家族蛋白对 LFA1 和 ICAM1 依赖的淋巴细胞黏附至关重要

为了确定 ATG8 家族蛋白（根据 GENE SKYLINE（ImmGen），LC3b 和 GABARAP 是淋巴细胞中的主要旁系同源物）对细胞黏附的重要性，研究人员建立了一种缺乏这两种蛋白表达的淋巴细胞系（图 2a）。Map1lc3b 和 Gabarap 的缺失不影响 LFA1 的表面表达（图 2b）；然而，Map1lc3b 和 Gabarap 基因敲除（KO）细胞（从此时起称为 LC3b - KO 和 GABARAP - KO 细胞）的黏附性明显低于野生型（WT）细胞（图 2c）。Rab7a 缺陷细胞（Rab7a - KO 细胞）的表型与 LC3b/GABARAP - KO 细胞相似（补充图 1g - i）。ATG8 家族蛋白诱导 LFA1 在细胞接触表面积累（图 2d），这表明这些蛋白通过调节接触表面的 LFA1 水平来调节 LFA1 依赖的淋巴细胞黏附。ATG8 家族蛋白的敲除减少了细胞黏附时形成的 LFA1 ICCs 的数量（补充图 4a，b，图 2e），这表明 ATG8 蛋白在 LFA1 聚集过程中起着至关重要的作用。

为了研究 LC3 在原代淋巴细胞黏附中的重要性，研究人员使用来自人密码子优化的酿脓链球菌 Cas9（hSpCas9）敲入（Cas9 - KI）小鼠的 T 细胞，建立了 LC3 表达降低的 T 细胞母细胞。从 Cas9 - KI 小鼠中分离出 T 细胞，在携带向导 RNA 的逆转录病毒存在下进行培养，并使用嘌呤霉素选择感染细胞（图 2f）。通过蛋白质免疫印迹验证了 T 细胞中 LC3 的下调（图 2g），而 LFA1 和 CD3 的表面表达水平相同（图 2h）。研究人员发现，TCR 和 ICAM1 依赖的细胞黏附以及 LFA1 在 T 细胞接触表面的积累也依赖于 LC3b（图 2i，j）。总之，这些结果表明 ATG8 家族蛋白作为淋巴细胞黏附性的正调节因子发挥着重要作用。

建立 SNAP KI 小鼠揭示了 LC3 对原代 T 细胞中 LFA1 聚集的重要性

为了进一步研究 LC3 对原代 T 细胞中 LFA1 聚集的重要性，研究人员通过在 LFA1 β2 亚基的 C 末端插入基因，生成了 SNAP - KI 小鼠（补充图 5a，b），因为使用抗体难以观察原代 T 细胞中的小鼠 LFA1。验证了从 SNAP KI 小鼠分离的 T 细胞中 SNAP 融合 β2 的表达（补充图 5c）。在黏附于 ICAM1 的原代 T 细胞和 B 细胞中观察到 β2 和 LC3 的共定位（补充图 5d）。接下来，研究人员将 SNAP - KI 小鼠与 Cas9 - KI 小鼠杂交，生成 SNAP - KI;Cas9 - KI 小鼠，并如前所述用于建立 LC3 表达降低的 T 细胞母细胞（图 2f）。T 细胞母细胞中 LC3 的下调对 β2 - SNAP、表面 LFA 或 CD3 的表达没有影响，这与图 2h 中的结果一致（补充图 5e）。然而，T 细胞母细胞中 LC3 表达的降低减少了 LFA1 ICC 的形成（补充图 5f）。这些结果支持了 LC3 在淋巴细胞黏附过程中促进 LFA1 聚集的观点，如图 2e 所示。

LFA1 + LC3 + 簇形成所需的信号级联

为了确定由内向外信号传导还是由外向内信号传导是对 LC3 和 LFA1 聚集重要的整合素激活信号，研究人员检测了双向信号刺激对 LC3 和 LFA1 共聚集的影响。由内向外信号传导刺激剂（如 PMA 和 SDF1）并未明显诱导共聚集，尤其是 LC3 的聚集（图 3a）。由泛 β2 单克隆抗体 TS1/18 诱导的由外向内信号传导也未明显诱导共聚集，而由 ICAM1 在 PMA 存在下诱导的由外向内信号传导，以及诱导高亲和力 LFA1 形成的单克隆抗体 mAb24，强烈诱导了共聚集。这一发现表明，高亲和力依赖的由外向内信号传导对于 LFA1 + LC3 + ICCs 的形成很重要（图 3a）。

接下来，研究人员通过测量暴露于每种刺激后 mTOR 的活性，比较了由外向内信号传导和饥饿对信号级联的影响。营养饥饿抑制 mTOR 活性。研究人员发现，由外向内信号传导促进了 mTOR 的底物 p70 S6 激酶（S6K）的磷酸化，而饥饿则降低了 S6K 的磷酸化（图 3b）。自噬机制通过 Unc - 51 样自噬激活激酶 1（ULK1，自噬体形成所需复合物的关键诱导物）在 Ser - 757（S757）处的去磷酸化而被激活。这在饥饿条件下的淋巴细胞中得到了重现；然而，由外向内信号传导并未降低 S757 的磷酸化（图 3b，补充图 6a）。AMPK 对 ULK1 在 Ser - 777（S777）处的磷酸化是自噬体形成的另一个标志。饥饿促进了 AMPK 对其代表性底物乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）的活性，以及 ULK1 在 Ser777 处的磷酸化。由外向内信号传导也增加了 AMPK 对 ACC 的活性，但并未明显增加 ULK1 在 S777 处的磷酸化（图 3b，补充图 6a）。这些结果共同表明，由外向内刺激并没有简单地劫持经典自噬机制，而是激活了 mTOR 和 AMPK，且不影响 ULK1 的磷酸化。

研究人员使用 mTOR 抑制剂雷帕霉素和 AMPK 激动剂 A769662 调节信号通路，进一步分析了这些信号级联对淋巴细胞功能的重要性。在淋巴细胞中证实了雷帕霉素对 mTOR 活性的抑制和 A769662 对 AMPK 的激活（补充图 6b）；然而，药物处理在黏附前不影响 LFA1 的表面表达（补充图 6c）。尽管雷帕霉素对淋巴细胞黏附性没有影响，但 A769662 通过上调细胞接触表面的 LFA1 增加了淋巴细胞黏附性（图 3c，d）。在 Prkaa1 基因敲除（AMPK - KO）的淋巴细胞（补充图 6d，e）中，虽然其 LFA1 表达水平与 WT 相同，但 AMPK 正向调节淋巴细胞黏附性（图 3e）、LFA1 聚集（图 3f）以及 LFA1 在接触表面的积累（图 3g）。这些发现表明，由外向内信号传导主要依赖 AMPK 信号来控制 LFA1 依赖的黏附。一致地，由外向内信号传导诱导的 LC3 聚集也受 AMPK 调节（图 3f）。为了进一步确定 AMPK 在淋巴细胞黏附中的作用，研究人员使用上述的 SNAP - KI;Cas9 - KI 小鼠建立了原代 AMPK - KO T 细胞母细胞（补充图 6f，g）。T 细胞母细胞中 AMPK 表达的降低减少了细胞黏附性（图 3h）、LFA1 ICC 的形成（图 3i）以及细胞接触表面的 LFA1 水平（图 3j）。这些结果支持了 AMPK 控制由外向内信号传导介导的 LFA1 和 LC3 聚集的观点。

整合素由外向内信号传导不诱导自噬体降解

在经典自噬途径中，饥饿抑制 mTOR 活性并诱导 LC3 脂化，导致自噬通量的发生，以降解被吞噬的底物。伴随自噬体的形成，自噬衔接蛋白（如 p62）募集泛素化底物。与经典自噬途径不同，由外向内信号传导不会刺激 p62 聚集或 LC3 - II（LC3 的脂化形式）的降解（补充图 7a，b），而 LC3 本身的脂化对于 LFA1 依赖的淋巴细胞黏附很重要（补充图 7c，d）。为了进一步研究由外向内信号传导在自噬诱导中的作用，研究人员使用自噬通量探针（补充图 8a）检测对由外向内信号传导刺激的反应（补充图 8a - c）。尽管由外向内信号传导不影响 GFP/RFP 比率，但暴露于饥饿条件下会显著降低 GFP/RFP 比率，这表明整合素依赖的 LC3 聚集不会诱导自噬通量（补充图 8d，e）。总之，这些结果表明 LC3 介导的淋巴细胞黏附与经典自噬通量的发生无关。

LFA1 和 LC3 的聚集以及聚集