SEED-Selection使原代T细胞在多个位点编辑后能够高效富集

具有多种遗传修饰的原代T细胞通过负选择快速分离。

　　

利用 SEED - Selection 技术高效富集多位点编辑的原代 T 细胞的研究解读

近日，Gladstone - UCSF 基因组免疫研究所、加利福尼亚大学旧金山分校等机构的 Christopher R. Chang、Vivasvan S. Vykunta 等研究人员在《Nature Biotechnology》期刊上发表了题为 “SEED - Selection enables high - efficiency enrichment of primary T cells edited at multiple loci” 的论文。该研究开发了一种名为 SEED - Selection 的一步法，可用于富集在多个靶位点含有敲入的未标记细胞，为复杂基因编辑细胞疗法的生产提供了有效的技术支持，在细胞治疗领域具有重要意义。

一、研究背景

T 细胞工程改造在治疗难治性血液恶性肿瘤方面展现出了一定的潜力，例如表达合成免疫受体的 T 细胞已被证明对相关疾病治疗有效。然而，目前细胞治疗的发展面临诸多挑战。一方面，维持 T 细胞的持久性和功能性存在困难，这限制了新细胞疗法的开发；另一方面，现有细胞治疗产品的自体性质导致其制造过程昂贵且耗时，阻碍了细胞疗法的广泛应用。

为改善细胞治疗的效果并开发通用型（现成的）产品，研究人员尝试通过 CRISPR - Cas 编辑将转基因组合整合到基因组中。但病毒和非病毒 DNA 修复模板的载量有限，限制了在单个位点引入的转基因数量和大小。同时，CRISPR - Cas 虽能在多个位点同时引入双链断裂（DSBs），但非同源末端连接（NHEJ）通常比同源定向修复（HDR）介导的转基因整合更易发生，导致实现多个转基因整合颇具挑战，且产生的部分编辑细胞群体可能性能欠佳。此外，产品纯度对于临床制造至关重要，因此需要高效的方法来分离完全编辑的细胞。

在细胞工程领域，分离经过基因编辑的细胞一直是研究热点，目前已开发出多种方法。如使用表面标签和耐药盒来富集含有转基因整合的细胞，但对细胞进行多种药物处理或连续进行阳性选择会对细胞活力、性能和产量产生负面影响；靶向必需位点虽可富集转基因整合细胞，但同时编辑多个必需基因的后果尚未明确；还有研究利用在一个位点引入的选择标记来富集另一个位点的整合，但缺乏直接多标记选择的富集方法，难以获得更纯的细胞群体。

二、研究材料与方法

（一）细胞来源与培养

研究使用来自匿名健康人类供体的原代成人血细胞，购买后冻存。通过 EasySep 分离试剂盒从解冻的细胞中分离出 CD3?、CD4?或 CD8? T 细胞，并在特定培养基中培养。此外，实验还用到了冷冻的原代人 NK 细胞，解冻后经激活用于功能测定。

（二）修复模板设计

设计了一种名为合成外显子表达破坏器（SEED）的修复模板。SEED 利用合成的剪接受体（SA）和剪接供体（SD）序列，在破坏靶蛋白的位置引入框内转基因有效载荷，同时使用 P2A 序列使 SEED 靶标提前截断，促进转基因表达。研究人员还对 HDRT（同源定向修复模板）的设计进行了详细规划，包括选择合适的整合位点、添加或去除特定序列以维持读码框和优化表达等。

（三）实验流程

通过电穿孔将细胞与核糖核蛋白（RNP）和 AAV（腺相关病毒）载体共转染，实现基因编辑。针对不同的实验目的，调整 RNP 的用量和 AAV 的感染复数（MOI）。编辑后的细胞经过培养和扩增，利用免疫磁珠法进行细胞分选，根据细胞表面标志物的表达情况去除未编辑或部分编辑的细胞，富集目标细胞群体。同时，研究人员还设计了多种实验来评估编辑效果，如通过流式细胞术检测细胞表面标志物和转基因表达，利用基因组 DNA PCR 验证基因编辑情况，使用 ddPCR（数字滴度 PCR）评估染色体易位频率，借助单细胞 RNA 测序评估染色体丢失情况等。

三、研究技术路线

SEED - Selection 技术的核心是将转基因整合与内源性表面蛋白的破坏相联系。研究人员设计了两种关键试剂：一是靶向表面表达蛋白内含子的向导 RNA（gRNA），其产生的 DSB 对蛋白表达影响较小；二是 SEED HDRT。当细胞发生转基因整合时，SEED HDRT 会破坏与之配对的内源性表面蛋白的表达，而未修饰和部分编辑的细胞则保留该蛋白的表达。通过免疫磁珠阴性选择，去除表达内源性表面蛋白的细胞，从而富集含有转基因整合的细胞（图 1a）。研究人员针对 T 细胞工程中常见的靶点 TRAC 和 B2M 设计 SEED，验证了该技术在单个位点和多个位点编辑中的有效性，并通过优化编辑条件和实验流程，提高了编辑效率和细胞纯度。

四、研究结果

（一）SEEDs 实现转基因整合细胞的富集

研究人员最初针对治疗性 T 细胞工程中两个常见的位点 TRAC 和 B2M 设计 SEED。通过筛选靶向内含子的 gRNA，确定了能在不破坏 TCR 或 B2M 表面表达的情况下高效产生插入缺失（indels）的 gRNA。将编码 CD19 特异性 CAR 和截断的表皮生长因子受体（EGFRt）标签的 SEED HDRT 导入 T 细胞后，发现超过一半（57.4%）的 SEED 转导细胞发生了整合介导的 TCR 破坏（TCR?CAR?）。通过免疫磁珠去除 TCR?细胞，可获得纯度高达 92.6% 的 TCR?CAR?细胞群体，产量可达 76%。与外显子靶向策略相比，SEED 能更有效地通过将转基因整合与靶蛋白破坏偶联来富集编辑细胞。

（二）NHEJ 抑制剂促进双等位基因 SEED 整合

在编辑 B2M 位点时，研究发现编辑两个等位基因对于完全破坏 B2M 表达至关重要。通过测试不同 MOI 的 AAV 和 NHEJ 抑制剂 M3814 的作用，发现使用最高 MOI 并添加 M3814 时，83% 的细胞实现了双等位基因 SEED 整合。在较低 MOI 或不使用 M3814 时，双等位基因整合仍可检测到，表明优化的编辑条件可使双等位基因整合成为主要编辑结果，但并非双等位基因整合发生的必要条件。

（三）SEED - Selection 分离双等位基因整合细胞

利用针对 B2M 的 SEED HDRT 编辑细胞后，进行免疫磁珠 B2M 耗竭实验。结果显示，免疫磁珠选择可有效去除 B2M?CD47?和 B2M?CD47?细胞，回收纯度大于 98% 的双等位基因 SEED 整合细胞（B2M?CD47?），产量可达 56%。对不同编辑分布的样本进行处理，发现 SEED - Selection 在不同编辑场景下均具有通用性，在低 MOI 转导的样本中，虽最终 B2M?CD47?细胞纯度低于高 MOI 样本，但 SEED - Selection 对其纯度的提升幅度更大。

（四）SEED - Selection 同时富集多位点编辑

研究人员同时对 TRAC 和 B2M 位点进行编辑，使用模拟临床前研究的 AAV 剂量（MOI 为 2×10?），发现高达 55% 的细胞实现了完全编辑（TCR?CAR?B2M?CD47?）。通过同时使用抗 TCR 和抗 B2M 抗体进行免疫磁珠耗竭，可分离出纯度高达 89.4% 的完全编辑细胞。进一步优化实验方案，采用 G - REX 培养瓶进行实验，在减少 85% 病毒用量（MOI 为 3×10?）的情况下，约 50% 的细胞实现了 TRAC 和 B2M 位点的完全编辑，且编辑后的细胞在 7 天内可扩增至 1.6×10?个完全编辑的 T 细胞。扩增后进行多重免疫磁珠耗竭，可将完全编辑细胞的比例从 50% 提高到 81%，产量可达 77%，表明 SEED - Selection 可用于分离具有多个理想整合的同质细胞产品。

（五）多位点低 MOI 编辑在临床规模上有效

研究人员使用符合良好生产规范（GMP）的试剂、设备和流程，对 1.6×10?个原代人 T 细胞进行 TRAC 和 B2M 位点的编辑。结果显示，71% 的细胞实现了完全编辑，经过 7 天的扩增，可获得高达 2.5×10?个完全编辑的细胞，证明了多位点整合策略在临床环境中可高效实施。

（六）表位编辑的人类白细胞抗原非依赖性 TCR 与 SEED - Selection 兼容

合成免疫受体如转基因 α/βTCRs 或人类白细胞抗原非依赖性 TCRs（HITs）对低抗原密度敏感，但与 TCR SEED - Selection 不兼容，因其会被用于耗尽未修饰和部分编辑细胞的抗 TCRα/β 抗体结合。通过对 HIT 的 β 恒定区（Cβ）进行扫描诱变和饱和诱变，研究人员确定了能破坏抗体结合且不影响受体功能的单个氨基酸替代位点，如 Cβ 残基 G102、D112 或 P116 的某些替代。将表位编辑的 HIT（HITK112）引入 TRAC 靶向的 SEED 并进行免疫磁珠纯化，可获得纯度大于 98% 的 HIT 细胞，且其功能与未修饰的 HIT 相似，表明表位编辑可使 HIT?细胞通过 SEED - Selection 富集而不影响受体功能。

（七）表位编辑的 TCR 可减少错配

T 细胞工程中，转基因 TCR 表达可能导致内源性和转基因 TCR 链错配，影响转基因 TCR 的表面表达和功能。研究人员对靶向 NY - ESO - 1 的 1G4 - LY 转基因 TCR 进行表位编辑，设计了 TRAC 外显子靶向的 HDRT。实验发现，表达 1G4 - LYWT 的细胞中，NY - ESO - 1 四聚体结合与 BW242 结合相关；而表达 1G4 - LYKI12 的细胞则出现了正确 TCR 配对（四聚体?BW242?）和错配（四聚体?BW242?）的不同群体。通过敲除内源性 TCRβ 链可消除错配群体。将 1G4 - LYKI12 引入 TRAC 靶向的 SEED 并进行编辑和免疫磁珠纯化，可有效去除内源性或错配的 TCR 细胞，回收纯度大于 98% 的正确配对 1G4 - LY * 细胞，产量可达 60%，表明 SEED - Selection 可用于去除具有不期望特异性的 T 细胞，而无需同时在 TRAC 和 TRBC 位点进行编辑。

（八）SEED 实现共受体和 TCR 同时交换

CD4? T 细胞在肿瘤免疫反应中具有重要作用，但 MHC - I 限制的 TCRs 在缺乏 CD8α/β 共受体时性能不佳。研究人员筛选了靶向 CD4 位点的非破坏性 gRNA，并设计了 SEED HDRT 共递送 CD8α 和 CD8β。实验结果显示，超过 75% 的 HDRT 转导 CD4 细胞实现了整合介导的 CD4 破坏（CD4CD8），通过免疫磁珠 CD4 耗竭可获得纯度大于 98% 的双等位基因 SEED 整合细胞（CD4CD8），产量可达 79%。编辑 T 细胞使其同时表达 1G4 - LYKI12 和 CD8α/β，与仅表达 1G4 - LYKI12 的细胞相比，前者的 NY - ESO - 1 四聚体结合增加，且在纵向细胞毒性试验中对表达 NY - ESO - 1 的黑色素瘤细胞系 A375 的控制能力增强。此外，研究人员还对 CD4? T 细胞进行三个位点的编辑和选择，可获得纯度高达 90% 的完全编辑细胞，表明 SEED - Selection 可在复杂编辑后分离完全编辑的细胞。

（九）多位点 SEED 编辑后的基因组稳定性评估

研究人员设计了数字滴度 PCR（ddPCR）检测和单细胞 RNA 测序工作流程，评估 SEED - Selection 对基因组稳定性的影响。在 TRAC、B2M 和 CD4 位点同时编辑 9 天后，发现使用 HDRTs 进行编辑时，染色体易位频率显著降低，且进一步通过 SEED - Selection 分离完全编辑的细胞并未显著改变易位频率。同时，研究还发现部分和完全染色体丢失在染色体 14 上更为频繁，但 HDRT 的存在和 SEED - Selection 对其发生频率没有显著影响。总体上，未发现 SEED - Selection 会富集涉及靶位点的大规模基因组重排。

五、研究结论与讨论

（一）研究结论

SEED - Selection 技术为分离多位点编辑的原代 T 细胞提供了一种高效、一步法且无药物的方法。该技术通过将转基因整合与内源性表面蛋白破坏偶联，可实现对单个位点和多个位点编辑细胞的高纯度富集，编辑细胞纯度最高可达 98%（单个修饰）和 90%（六个同时编辑） 。同时，研究还优化了编辑条件和实验流程，提高了编辑效率，在临床规模实验中实现了高效的多位点整合。此外，通过表位编辑解决了合成免疫受体与 SEED - Selection 不兼容的问题，并利用该技术减少了 T 细胞工程中的 TCR 错配，为细胞治疗产品的优化提供了新策略。在基因组稳定性方面，SEED - Selection 不会富集平衡易位或染色体丢失，确保了编辑细胞的基因组完整性。

（二）讨论

SEED - Selection 技术具有诸多适用于临床应用的特点。它无需表达可能引发免疫反应的外源性蛋白，如耐药盒；基于免疫磁珠阴性选择的方式不会直接改变产品的活力和基因组完整性；可同时富集多个 SEED，且能最大限度减少在无关位点引入 DSB 的需求。然而，该技术在设计和应用时也有一些需要考虑的因素。SEED HDRTs 必须整合在编码非细胞生存必需的细胞表面蛋白的位点；实验中使用的内源性启动子虽能最大化 HDRT 有效载荷容量，但可能无法为某些有效载荷提供最佳转录调控；在 SEED - Selection 过程中，单等位基因整合的潜在功能细胞会被耗尽，且完全编辑的细胞可能在纯化过程中丢失，因此该技术最适用于免疫磁珠纯化已被要求或双等位基因转基因整合对治疗活性至关重要的应用场景。

尽管该研究仅在研究规模（每次纯化 < 2×10 个细胞）上对 SEED - Selection 进行了测试，但已有针对临床制造常用的自动化细胞处理平台 CliniMACS Prodigy 开发的大规模多靶点免疫磁珠耗竭协议。随着基因组编辑技术的不断发展，更复杂的 SEED - Selection 策略有望得以实施。该研究成果为当前细胞治疗产品的制造提供了更高效的方法，有望推动更先进细胞疗法的开发，在细胞治疗领域具有重要的应用前景和研究价值。