Nature合成生物学新突破：单个终止密码子的基因组重编码生物

Ochre是大肠杆菌的一种菌株，它被设计成具有单个终止密码子，可以重新分配四个密码子，以实现非简并功能，例如将非标准氨基酸整合到蛋白质中。

　　

合成生物学新突破：构建单终止密码子基因组重编码生物

耶鲁大学（Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University）的 Michael W. Grome 等人在《Nature》杂志上发表了题为 “Engineering a genomically recoded organism with one stop codon” 的论文。该研究通过对大肠杆菌进行基因组重编码，成功构建了一种将翻译功能压缩到单个终止密码子的基因组重编码生物（GRO）——Ochre，为遗传密码的研究和应用开辟了新方向，在生物技术、生物治疗以及基础生物学研究等领域具有重要意义。

一、研究背景

遗传密码在生命的各个领域中高度保守，但也存在一些例外情况，这些例外揭示了密码子分配和相关翻译因子的变异。受自然遗传密码可塑性的启发，合成生物学领域尝试通过全基因组同义密码子替换来构建具有替代遗传密码的基因组重编码生物（GROs），这种生物具有增强噬菌体抗性、生物遏制以及高效位点特异性掺入非标准氨基酸（nsAAs）等优势。然而，此前的研究尚未充分利用翻译因子的可塑性和密码子简并性，将翻译功能压缩到单个密码子，也未评估非简并密码子的可行性。实现将冗余密码子功能压缩到单个密码子，并构建非简并基因组，有助于拓展体内蛋白质设计，赋予生物材料和药物新的特性，如抗蛋白酶水解等。但这需要对关键翻译因子（tRNA 和释放因子）进行工程改造，使其具有特定的单密码子特异性，减少密码子之间的翻译串扰，并消除同义密码子之间的功能冗余，目前这些方面仍面临诸多挑战。

二、研究材料与方法

（一）实验菌株

研究以 ΔTAG 的大肠杆菌 C321.ΔA4（即 rEcΔ1.ΔA）为起始菌株，在此基础上进行后续的基因改造和实验。

（二）主要技术方法

1. 基因组重编码技术：利用多重自动化基因组工程（MAGE）技术将基因组中的 TGA 终止密码子转换为 TAA，同时结合共轭组装基因组工程（CAGE）技术，将重编码的基因组片段组装成最终的重编码菌株 rEcΔ2.ΔA。

2. 翻译因子工程改造：对释放因子 2（RF2）和 tRNA^Trp 进行工程改造。通过 MAGE 技术向 prfB 基因引入多个突变，包括 T246A、S205P、E170K 等，以改变 RF2 的终止密码子识别特异性；对编码 tRNA^Trp 的 trpT 基因进行改造，将 A37 突变为 G37（tW*），以消除 tRNA^Trp 对 UGA 的识别。

3. 检测与分析方法：运用全基因组测序（WGS）和 breseq 分析来评估背景突变；通过体内荧光报告实验（如 mCherry - YFP 荧光报告实验）和噬菌体感染实验来检测 RF2 变体的终止活性和遗传正交性；利用质谱技术（MS - READ）分析非标准氨基酸的掺入效率和准确性；通过测量菌株在不同培养基中的生长曲线、倍增时间和最大 OD600 来评估菌株的生长适应性。

三、研究技术路线

（一）构建 ΔTAG/ΔTGA 重编码菌株

以 rEcΔ1.ΔA 为基础，首先确定需要改造的 TGA 密码子相关基因，通过删除部分非必需基因和运用 MAGE 技术将剩余的 TGA 密码子转换为 TAA。整个过程分为两个主要阶段，每个阶段都利用 MAGE 技术同时针对不同的基因组亚区域进行改造，然后通过 CAGE 技术将重编码的亚区域组装成最终的 rEcΔ2.ΔA 菌株。在构建过程中，通过全基因组测序确认 TGA - to - TAA 的转换情况，并对菌株的生长表型进行监测，选择生长性能较好的菌株进行后续实验。

（二）工程改造突变体 RF2

为实现 UAA 特异性的翻译终止，解除 UGA 的翻译串扰，对 RF2 进行工程改造。通过引入多个突变，包括恢复野生型释放因子甲基化的 T246A、实现 UAA 特异性终止活性的 S205P 以及维持菌株活力的 E170K 等。利用体内荧光报告实验和噬菌体感染实验，评估这些突变对 RF2 功能的影响，筛选出具有理想终止活性和遗传正交性的 RF2 变体。

（三）消除 tRNA^Trp 对 UGA 的抑制

通过质谱分析发现 tRNA^Trp 对 UGA 有显著的抑制作用，为减少这种抑制，对 tRNA^Trp 进行改造。基于对 tRNA 反密码子环修饰与密码子识别关系的研究，将 tRNA^Trp 的 A37 突变为 G37，构建 rEcΔ2.?A.B3.tW*（Ochre）菌株。利用 mCherry - YFP 荧光实验和质谱分析，验证该突变对 UGA 抑制的消除效果以及对非标准氨基酸掺入的影响。

（四）非标准氨基酸双掺入蛋白实验

构建双正交翻译系统（OTS）荧光报告质粒，用于评估 rEcΔ2.?A.B3 和 rEcΔ2.?A.B3.tW*（Ochre）菌株在报告蛋白中于 UAG 和 UGA 位点掺入两种不同非标准氨基酸（para - acetyl - L - phenylalanine，pAcF；N^ε - Boc - L - lysine，BocK）的能力。通过荧光表达分析和质谱检测，确定非标准氨基酸的掺入效率和准确性，并评估菌株的翻译准确性和实用性。

四、研究结果

（一）构建 ΔTAG/ΔTGA 重编码菌株

通过 MAGE 和 CAGE 技术，成功构建了 ΔTAG/ΔTGA 重编码菌株 rEcΔ2.ΔA。在该菌株中，1216 个预测的 TGA 密码子中有 1195 个被消除，仅留下 10 个预测的假基因、8 个插入序列和 3 个内部硒代半胱氨酸密码子未重编码。尽管最终的重编码菌株积累了 700 多个意外的背景突变，但通过对细胞生长表型的监测和筛选，有效减轻了这些突变的不利影响。

（二）工程改造突变体 RF2

经过对 RF2 的工程改造和筛选，获得了 RF2.B3 变体。体内荧光报告实验结果显示，与野生型 RF2 相比，RF2.B3 对 UGA 的识别显著减弱，在 UGA 位点的通读率提高，而在 UAA 位点仍能维持有效的终止功能。噬菌体感染实验表明，RF2.B3 在一定程度上恢复了 UGA 的终止功能，且该变体的出现使菌株对噬菌体感染的抗性发生变化，这进一步证明了 RF2.B3 的功能特性。

（三）消除 tRNA^Trp 对 UGA 的抑制

将 tRNA^Trp 的 A37 突变为 G37 后，构建的 rEcΔ2.?A.B3.tW * 菌株显著降低了 tRNA^Trp 对 UGA 的抑制。mCherry - YFP 荧光实验和质谱分析结果表明，该突变消除了 UGA 处的 Trp 掺入，为 UGA 密码子的重新分配创造了条件，使 UAG、UGA、UAA 和 UGG 这四个密码子实现了翻译隔离和功能专一化。

（四）非标准氨基酸双掺入蛋白实验

在非标准氨基酸双掺入实验中，rEcΔ2.?A.B3.tW*（Ochre）菌株表现出优异的性能。与未重编码的菌株相比，该菌株在 UAG 和 UGA 位点双掺入 BocK 和 pAcF 的效率显著提高，且质谱分析显示其掺入准确性超过 99%。此外，从 Ochre 菌株中纯化得到的含有双掺入非标准氨基酸的 ELP - GFP 蛋白产量约为 2mg/L，比未重编码的 BL21 菌株高约 21 倍，这充分展示了该菌株在生产含有非标准氨基酸的蛋白质方面的巨大潜力。

五、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究通过整合基因组、生物分子和蛋白质工程技术，成功构建了基因组重编码生物 Ochre。在 Ochre 中，实现了将终止密码子功能压缩到 UAA，同时将 UAG 和 UGA 解放出来用于重新分配，使其能够以超过 99% 的准确性在蛋白质中多位点掺入两种不同的非标准氨基酸。这一成果表明，将翻译因子工程与基因组重编码相结合，能够更全面地压缩、释放和准确重新分配密码子，为构建非简并遗传密码的基因组奠定了基础。

（二）研究讨论

从密码子识别角度来看，本研究强调了翻译因子解码的复杂性，这涉及到高度精确的结构相互作用、浓度动力学以及对密码子的竞争。研究还发现，RF2 的解码受到识别环以外的残基（如 E170K）的影响。未来的重编码研究需要进一步优化密码子识别，可借鉴 tRNA^Trp 的改造思路，通过对自然反密码子修饰的调整来实现更精准的密码子隔离，同时也可探索核糖体组件或 RF3 在调节解码中的作用。

在基础生物学研究方面，本研究为深入理解遗传信息传递机制提供了新视角。例如，在实验过程中出现的 RF3 自发突变，有助于揭示翻译的调控机制；TGA 密码子的替换使研究人员能够探究密码子冗余和在密码子压缩过程中被去除的隐秘密码子功能。此外，不同 tRNA 在压力条件下对 UGA 密码子的差异抑制可改变细胞转录模式，这体现了终止密码子的非同义功能，也提示未来的重编码研究应关注翻译因子或密码子的替代功能。

从应用前景来看，本研究成果在多个领域具有重要价值。在保障转基因生物安全方面，可利用增强的遗传隔离和生物遏制特性，有效防止基因水平转移；在生物制造领域，拓展了生产全新合成蛋白质、生物材料和治疗药物的能力，为开发具有独特功能的生物产品提供了有力工具。

本研究在遗传密码工程领域取得了重要突破，为后续研究开辟了新方向，有望推动合成生物学在基础研究和实际应用中的进一步发展。