滤泡性淋巴瘤中，STAT6突变补偿CREBBP突变，并过度激活IL4/STAT6/RRAGD/mTOR信号

　　

滤泡性淋巴瘤研究新突破：STAT6 突变与 IL4/STAT6/RRAGD/mTOR 信号通路激活

在滤泡性淋巴瘤（FL）的研究领域，美国密歇根大学内科血液学和肿瘤学系的 Qiangqiang Shao、Isabella A. Malek 和 Sami N. Malek 等研究人员取得了重要进展。他们的研究成果以 “LYMPHOMA STAT6 mutations compensate for CREBBP mutations and hyperactivate IL4/STAT6/RRAGD/mTOR signaling in follicular lymphoma” 为题，发表于知名期刊Leukemia。这一研究为深入理解滤泡性淋巴瘤的发病机制提供了新视角，也为开发针对该疾病的新型治疗策略奠定了基础。

一、研究背景

滤泡性淋巴瘤是最常见的惰性 B 细胞淋巴瘤，在美国，其发病率约为 14,000 例，患病率约为 100,000 例 。目前，传统疗法难以治愈 FL，且针对 FL 的靶向药物研发滞后于其他淋巴瘤。FL 的临床病程和生物学特性多样，受肿瘤细胞内在因素和微环境的影响。其中，IL4/IL4R 信号通路通过 JAKs 和 STAT6 发挥作用，对 FL B 细胞和正常 B 细胞产生影响。IL-4 在 FL B 细胞微环境中水平升高，这是由于滤泡辅助性 T 细胞（Tfh 细胞）分泌增加。

STAT6 激活突变在滤泡性淋巴瘤、转化型 FL 以及其他多种 B 细胞淋巴瘤中较为常见。已有研究表明，携带 STAT6 突变的 FL 患者，其无进展生存期较短 。然而，关于 IL4 和 STAT6 在原代人 B 淋巴细胞中诱导的转录程序，以及 STAT6 突变蛋白对该反应的影响，相关信息有限。此外，STAT6 突变赋予淋巴瘤细胞的生物学特性，以及对淋巴瘤淋巴结微环境的影响也大多未知。

二、研究材料与方法

（一）样本采集与伦理审批

淋巴瘤患者在签署密歇根大学机构审查委员会批准的知情同意书后，被纳入密歇根大学罗格尔综合癌症中心的两个淋巴瘤储存库。所有标本的基因组研究均获得批准，且所有研究均遵循赫尔辛基宣言的伦理准则。

（二）基因表达分析

研究人员从人淋巴结活检样本中分离纯化非恶性 B 淋巴细胞和滤泡性淋巴瘤 B 淋巴细胞，采用批量 RNA 测序技术进行基因表达分析。具体步骤包括细胞解冻、洗涤，利用 Miltenyi 磁珠和柱子去除 CD3 T 细胞和 CD14 巨噬细胞，在有无 IL4 的条件下培养细胞，使用 Trizol 试剂和 RNAeasy 柱纯化总 RNA，通过 Bioanalyzer 和 Qubit RNA 高灵敏度检测评估 RNA 质量，采用 Takara SMART stranded 试剂盒进行测序。测序数据经过质量控制、比对和定量分析，相关测序文件已上传至基因表达综合数据库（GEO）。

（三）细胞系构建

利用慢病毒转导技术，构建表达 HA 标记的野生型或突变型 STAT6 的淋巴瘤细胞系；通过 CRISPR-Cas9 技术，构建 CREBBP 和 RRAGD 敲除的淋巴瘤细胞系。细胞系的构建过程经过验证，包括免疫印迹检测蛋白表达、STR 服务进行细胞系鉴定等。

（四）细胞处理与检测

对重组淋巴瘤细胞系和纯化的人淋巴结来源的非恶性 B 淋巴细胞进行不同处理，如 IL4 处理、BCR 交联等，然后收集细胞裂解液，通过免疫印迹法检测相关蛋白的表达和磷酸化水平，以此研究信号通路的激活情况。

（五）统计分析

运用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，采用多种统计检验方法，如 Mann-Whitney 或 Wilcoxon 检验比较两组变量，ANOVA 或 Friedman 检验进行多组比较等。设定 5% 的显著性水平，统计结果以特定符号表示。

三、研究结果

（一）IL4 响应转录组分析

研究人员对正常 B 淋巴细胞（NBC）、野生型 STAT6 的 FL B 淋巴细胞（FL WT）和突变型 STAT6 的 FL B 淋巴细胞（FL MUT）在 IL4 刺激前后进行 RNA 测序。PCA 分析显示样本按样本 ID 分组，且 NBC 细胞与 FL 样本分离。通过比较不同组的基因表达，发现 IL4 处理后，NBC 淋巴细胞中有 44 个基因表达显著变化，其中包括 mTOR 调节因子 RRAGD。与 FL WT 样本相比，FL MUT 样本中大多数基因的基线表达和 IL4 刺激后的表达显著增加，证实了 STAT6 突变的功能获得表型。研究人员还发现一些在 FL MUT 样本中特异性诱导表达的基因，如 JAG2、BARX2 和 CHM2，这些基因可能与淋巴瘤的发病机制相关。

（二）CREBBP 突变对 IL4/JAK/STAT6 信号通路的影响

研究发现，FL 中携带野生型 STAT6 的细胞，其基线和 IL4 诱导的基因表达水平显著低于 NBC 淋巴细胞或携带突变型 STAT6 的 FL B 淋巴细胞，这表明 IL4/JAK/STAT6 信号轴在 FL WT 中下调。进一步研究发现，FL 中 CREBBP 突变频率较高，且与 STAT6 突变存在共发生现象。通过构建 CREBBP 敲除的淋巴瘤细胞系，研究证实 CREBBP 是 IL4 诱导基因表达的重要正协同因子，其缺失会消除 IL4 诱导的基因表达程序。这解释了 FL WT 中基因表达水平降低的原因，也暗示 FL 选择 STAT6 突变来补偿 CREBBP 突变导致的 IL4/JAK/STAT6 轴的减弱。

（三）STAT6 突变对 IL4 诱导基因表达的挽救作用

通过分析不同基因型（CREBBP WT 或 MUT 和 STAT6 WT 或 MUT）的 IL4 诱导基因表达，研究人员发现，在 CREBBP MUT/STAT6 MUT 的 FL 中，大多数基因的表达水平高于 CREBBP MUT/STAT6 WT 的 FL。在 CREBBP 敲除的细胞系中导入 STAT6 突变体，结果显示 STAT6 突变体能够提高大多数 IL4 响应基因的表达，这表明 STAT6 突变可以挽救 CREBBP 突变导致的 IL4 诱导基因表达的减弱。

（四）IL4 对 RRAGD 表达及 mTOR 激活的影响

研究表明，IL4 处理可显著诱导淋巴瘤细胞系和正常 B 淋巴细胞中 RRAGD 蛋白的表达。在正常 B 淋巴细胞中，IL4 处理不仅诱导 RRAGD 表达增加 2.1 倍，还能增强 BCR 诱导的 mTOR 激活，使 p-S6K 表达升高 3.6 倍。这表明 IL4 通过诱导 RRAGD 表达，增强了 mTOR 通路对 BCR 交联的激活反应。

（五）RRAGD 在淋巴瘤 mTOR 信号通路中的关键作用

研究人员构建 RRAGD 敲除的淋巴瘤细胞系，发现 RRAGD 的缺失完全阻断了 S6K 的磷酸化，并显著降低了 4EF-BP1 的磷酸化水平。这表明 RRAGD 在淋巴瘤细胞的 mTOR 激活中具有不可替代的作用，且 RRAGC 无法补偿 RRAGD 的缺失。

（六）STAT6 突变对 IL4/BCR 激活 mTOR 信号通路的影响

构建表达野生型或突变型 STAT6 的重组淋巴瘤细胞系，研究发现 IL4 处理增强了 BCR 诱导的 mTOR 激活，且在表达突变型 STAT6 的细胞系中，这种激活作用更为显著。同时，IL4 和 BCR 交联联合处理可强烈诱导 RRAGD 表达，且 STAT6 突变体进一步增强了这种诱导作用。这表明 STAT6 突变可超激活 IL4/STAT6/JAK/RRAGD/mTOR 信号轴，促进淋巴瘤细胞的生长和代谢。

四、研究结论与讨论

本研究通过对正常人和滤泡性淋巴瘤患者 B 淋巴细胞的研究，揭示了 STAT6 突变在滤泡性淋巴瘤中的多种作用机制。STAT6 突变表现为功能获得，导致大多数 IL4 响应基因的诱导幅度增加；发现多个与淋巴瘤细胞功能相关的新基因受 IL4 诱导；证实 CREBBP 是 STAT6 靶基因诱导的协同因子，FL 中野生型 STAT6 伴随 CREBBP 突变会减弱 IL4/JAK/STAT6 诱导的基因表达程序，而 STAT6 突变可挽救这一缺陷；明确 mTOR 调节因子 RRAGD 对淋巴瘤中 mTOR 激活至关重要，且受 IL4 转录上调，IL4 通过诱导 RRAGD 使 mTOR 通路对 BCR 交联更敏感，STAT6 突变则强烈增强 IL4 和 BCR 信号激活的 mTOR 信号。

这些发现为深入理解滤泡性淋巴瘤的发病机制提供了新的视角。研究鉴定出的新基因及其功能，有助于详细剖析 IL4/JAK/STAT6 轴激活以及 STAT6 突变上调该轴的后果。此外，研究结果还为未来的研究提供了丰富的方向，如探索 IL-4/JAK/STAT6/RRAGD/mTOR 轴作为小分子（JAK 抑制剂或 mTOR 抑制剂）治疗靶点的可行性，有望为滤泡性淋巴瘤的治疗带来新的突破。