非运动状态下艰难梭菌毒力与生理的调控机制：鞭毛蛋白稳态检查点FliC-FliW-CsrA的作用解析

这篇研究揭示了艰难梭菌（C. difficile）中鞭毛蛋白（FliC）及其调控网络FliC-FliW-CsrA在非运动状态下对毒力与代谢的核心作用。通过基因编辑和动物模型实验，发现FliW通过直接结合毒素正调控因子TcdR抑制毒素（TcdA/TcdB）产生，而CsrA通过5′-UTR结合负调控fliC表达。该研究为理解非运动菌株的致病机制提供了新视角，揭示了鞭毛相关蛋白在毒力调控中的非经典功能。

　　

非运动型艰难梭菌中FliC-FliW-CsrA网络的独特作用

ABSTRACT

艰难梭菌（Clostridioides difficile）的鞭毛蛋白FliC突变体在动物模型中表现出超强毒力，其毒素产量增加且中心代谢发生改变。研究发现，即使在缺乏运动能力的进化分支5菌株（如核糖型078的CD1015）中，尽管丢失了大部分鞭毛合成基因，仍保留了鞭毛蛋白基因fliC及其调控基因fliW和csrA。这提示FliC-FliW-CsrA网络可能独立于鞭毛功能参与毒力调控。

FliC-FliW-CsrA网络负调控毒素产生

通过CRISPR-Cas12a系统构建的系列突变体显示，ΔfliW单突变及含ΔfliW的组合突变（如ΔfliCΔfliW、ΔfliWΔcsrA）毒素产量显著升高，而ΔfliCΔcsrA双突变则恢复至野生型水平。回补实验证实，单独表达fliW即可抑制所有突变体的毒素过量产生，甚至使毒素水平低于野生型。动物感染实验中，ΔfliW相关突变体导致小鼠死亡率达70%-90%，且疾病严重程度评分（CSS）最高，与体外毒素数据高度一致。

分子互作机制解析

细菌双杂交（BACTH）和免疫共沉淀（Co-IP）揭示了三元网络的相互作用模式：

1. FliC与FliW直接结合，FliW与CsrA形成复合物，但FliC与CsrA无直接互作。

2. CsrA通过结合fliC转录本的5′-UTR（尤其是与核糖体结合位点重叠的CBS2）抑制翻译，而FliW可拮抗CsrA的抑制作用。

3. 意外发现FliW与毒素正调控因子TcdR直接结合，通过隔离TcdR抑制毒素基因转录。启动子报告实验显示，ΔfliW中tcdA启动子驱动的mCherry表达增强3倍。

代谢重编程与适应性优势

表型微阵列（Biolog）分析发现，ΔfliC、ΔfliW和ΔcsrA突变体对甘露糖和海藻糖的利用能力显著增强。在含40 mM甘露糖的最小培养基（CDMM）中，突变体生长速率远超野生型；而在海藻糖中则延迟裂解。竞争实验表明，突变体在特定碳源中可快速取代野生菌株，提示该调控网络可能通过代谢适应增强宿主体内定植优势。

临床意义与进化视角

研究首次揭示：

1. 非运动型艰难梭菌通过保留FliC-FliW-CsrA网络，将鞭毛相关蛋白"改造"为毒力调控开关。

2. FliW作为核心节点，既能通过经典的三元反馈调控fliC表达，又通过"劫持"TcdR协调毒素产生与代谢状态。

3. 该机制或解释临床分离的clade 5菌株（如RT078）的高致病性——尽管丧失运动能力，仍可通过精细化调控网络增强环境适应力。

未来方向

研究遗留的关键问题包括：环境信号（如碳源波动）如何动态调节FliW的分配（与FliC/CsrA或TcdR结合）；该网络是否影响生物膜形成等其他毒力特征。这些发现为开发针对毒素非依赖途径的抗感染策略提供了新靶点。