利用单条截短向导 RNA 实现多位点 CRISPRi 靶向：解锁基因组调控奥秘的新钥匙

在功能基因组学研究中，明确非编码元件对基因表达等的作用至关重要。研究人员开展基于 CRISPRi 的多位点筛选研究，用单条截短向导 RNA 可靠破坏增强子活性。该成果为测试转录因子结合基序等提供有效方法，意义重大。

　　在生命科学的奇妙世界里，基因调控就像一场精密的交响乐，而转录因子（TFs）与顺式调控元件（CREs）则是这场演出的关键指挥家与乐谱。人类基因组中，超过 100 万个 CREs 参与调控基因表达，它们和 TFs 相互协作，构建起复杂的调控网络，影响着细胞功能与疾病发生。然而，要搞清楚 TFs 如何精准地结合特定基序，以及这种结合会产生怎样的功能影响，却困难重重。一方面，候选元件数量庞大且结构复杂；另一方面，传统的 CRISPR 干扰（CRISPRi）技术在大规模研究 CREs 时，受限于大量的假定元件和较小的效应量，难以全面深入地解析基因调控的奥秘。为了突破这些困境，来自 Broad Institute of MIT and Harvard 的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为基因调控研究开辟了新的道路。

研究人员采用了一系列先进的技术方法来开展这项研究。在细胞模型方面，使用了 Jurkat、K562、MV4 - 11、HEK293FT 和 A375 等多种细胞系。通过构建 CRISPRi 载体，将催化失活的 Cas9（dCas9）与锌指抑制蛋白（KRAB）融合，实现对基因转录的沉默调控。利用染色质免疫沉淀测序（ChIP - seq）技术，分析蛋白质与 DNA 的结合情况；借助 RNA 测序技术，检测基因表达的变化。同时，运用了定量实时聚合酶链式反应（qRT - PCR）对特定基因的表达进行定量分析。

下面来看看具体的研究结果。

• 截短向导 RNA 实现 CRISPRi 靶向：研究人员首先探究了 CRISPRi 介导抑制所需的最小向导长度。以 CD81 作为报告基因，通过流式细胞术检测发现，5’端截短的向导 RNA 在 Jurkat 细胞中，最短至 9nt 仍能有效介导抑制，而 Cas9 切割所需的最短向导长度为 17nt，这表明 CRISPRi 在使用截短向导 RNA 方面具有独特优势。在 A375 细胞中的实验也验证了截短向导 RNA 的有效性，RNA 测序显示，20nt 和 g [9nt] 长度的向导 RNA 都能有效抑制 CD81 表达，且 g [9nt] 处理组还下调了 32 个其他靶标。
• 截短向导 RNA 破坏增强子：为了研究截短向导 RNA 能否靶向多个 TF 基序序列来破坏增强子，研究人员选取了 EPB41 基因上游的一个增强子区域。该区域包含多个假定的 TF 结合位点，他们设计了针对不同 TF 基序（PU.1、SP1、YY1 和 NR2）的全长和截短向导 RNA。实验结果显示，多数 11nt 的截短向导 RNA 能有效降低 EPB41 的表达，与全长向导 RNA 效果相当，证明了 CRISPRi - 截短向导 RNA 可以有效破坏增强子。
• CTCF 导向的截短向导 RNA 文库筛选：研究人员构建了一个包含 24 条 10nt 向导 RNA 的文库，靶向超过 13,000 个 CTCF 结合位点。在 Jurkat 细胞及其他多种细胞系（A375、K562、MV4 - 11 和 HEK293）中进行筛选，发现多数截短向导 RNA 不会导致细胞致死，部分向导 RNA 会引起细胞适应性变化。进一步研究发现，单个 5’碱基的变化对向导 RNA 的功能影响较小，这表明该筛选方法具有一定的特异性。
• 同时靶向 CTCF 结合位点：对 sg4 进行深入研究，ChIP - seq 分析表明，转导 sg4 和 CRISPRi 的 Jurkat 细胞中，CTCF 在完美匹配位点的占有率显著下降，同时 H3K9me3 信号显著增加，dCas9 在完美匹配位点有强结合，证明了截短向导 RNA 能在多个序列匹配的基因组位点有效破坏 CTCF 结合。设计更长的 13nt 向导 RNA aag [sg4] 进行实验，发现其导致的 CTCF 损失比 sg4 更大。对另一个向导 RNA sg8 的研究也得到了类似结果，且 sg8 靶向导致 67 个基因上调，这些基因主要集中在角蛋白丝和中间丝基因程序中。
• 被破坏的 CTCF 位点的特征：通过分析大量 JASPAR CTCF 结合位点，研究人员发现 sg4 和 sg8 能使数百个 CTCF 位点的结合减少，超过一半的靶向 CTCF 峰丢失。在部分匹配位点（与 10nt 向导 RNA 有≤9nt 互补性）中，也有一定比例的位点出现 CTCF 结合显著下降的情况，且多数受影响的部分匹配位点只有 1nt 错配，这体现了截短向导 RNA 对靶向 CTCF 位点具有较强的序列特异性。此外，研究人员还筛选出 88 种可用于截短向导 RNA 靶向的脊椎动物蛋白，为后续研究提供了新的方向。

在研究结论与讨论部分，研究人员成功展示了使用短至 9nt 的截短向导 RNA 进行多位点 CRISPRi 靶向的有效性。这一方法独特之处在于，单个截短向导 RNA 可同时靶向数百个 TF 结合位点，大大拓展了 CRISPRi 的靶向范围。利用 24 条 10nt 向导 RNA 组成的文库，实现了对大量 CTCF 位点的筛选，为研究 CTCF 的功能提供了有力工具。同时，该方法在多种细胞系中都能有效发挥作用，具有良好的通用性。然而，研究也指出，在设计截短向导 RNA 文库时，需要考虑种子序列、PAM 位点等因素对靶向效率的影响。此外，不同 TFs 和 DNA 结合蛋白的结合位点被靶向的效率可能存在差异，未来需要进一步优化筛选策略。总体而言，这项研究为功能基因组学研究提供了一种高效、便捷的筛选方法，有助于深入理解基因调控机制，为疾病研究和治疗靶点的发现奠定了坚实基础。