基于微尺度热泳技术的RNA甲基转移酶活性检测新方法助力DNMT2抑制剂发现

本研究针对RNA甲基转移酶(MTase)药物研发中检测技术通量低、成本高的瓶颈问题，开发了一种基于分裂适配体的微尺度热泳(MST)检测方法。研究人员通过改造天然metH核糖开关适配体，构建了可特异性识别S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的荧光生物传感器，成功应用于METTL3/14、DNMT2、NSUN2和S. aureus TrmD等多种RNA MTase的酶活检测与抑制剂筛选。该方法具有非专利、高灵敏度(检测限<50 nM)和低成本(<0.05美元/反应)优势，并通过DNMT2抑制剂筛选发现多个微摩尔级活性化合物，为表观遗传药物开发提供了新工具。

　　

在RNA表观遗传学研究如火如荼的今天，RNA甲基化修饰作为调控基因表达的关键机制，已成为抗癌和抗感染药物开发的新靶点。然而这个领域长期面临一个技术瓶颈：现有RNA甲基转移酶(MTase)活性检测方法要么依赖昂贵的质谱或放射性标记，要么受限于商业试剂盒的高成本(5美元/反应)，严重制约了药物筛选效率。面对这一挑战，德国美因茨大学医学中心的研究团队在《Communications Chemistry》发表创新成果，他们巧妙改造细菌天然SAH核糖开关，开发出革命性的微尺度热泳检测技术，为RNA甲基化研究开辟了新途径。

研究团队采用分裂适配体策略，将68nt的metH核糖开关适配体在A50位点拆分，分别标记FAM/TAMRA荧光团构建生物传感器。通过系统优化建立了MST和FRET双平台检测体系，其中MST方案展现出41dB信噪比和0.84 Z因子，灵敏度达24nM。该方法成功应用于DNMT2、METTL3/14等四种MTase的酶动力学研究，并完成240个化合物的筛选，发现包括alexidine(KD=364μM)和adamantanyl-acryloylurea(IC₅₀=4.1μM)在内的新型抑制剂。

关键技术包括：1)基于天然metH核糖开关设计分裂适配体生物传感器；2)建立微尺度热泳(MST)和荧光共振能量转移(FRET)双检测平台；3)开发适用于DNMT2、METTL3/14等不同MTase的标准化反应体系；4)采用荧光偏振(FP)和电泳迁移率(EMSA)进行正交验证；5)开展共价和非共价化合物库筛选。

设计与校准FRET/MST兼容的SAH分裂适配体

通过截短D. aromatica的metH核糖开关(去除P3茎)，团队获得对SAH具有20nM亲和力的核心序列。分裂设计后，aptaSAH1/2在MST平台展现24nM KD值和300倍SAH/SAM选择性，显著优于FRET方案(33dB信噪比)。与商业AptaFluor试剂盒相比，该方案成本降低100倍且公开所有序列信息。

RNA MTase活性表征与抑制研究

在DNMT2模型中，该方法成功重现文献报道的慢动力学特征(k_cat=0.025 min^-1)，并验证SHO108/SH112抑制剂的μM级活性。对METTL3/14的检测显示5.1nM STM2457抑制常数，与抗体法结果一致。针对热不稳定NSUN2，发现4℃无BSA保存可维持14天活性，解决了该酶的应用难题。

DNMT2抑制剂筛选发现

通过160化合物表观遗传库筛选，发现alexidine能可逆竞争SAH结合位点(FP验证)，而其他9个hit化合物通过破坏DNMT2-tRNA相互作用发挥抑制(EMSA证实)。80化合物共价库筛选则发现靶向Cys-79的adamantanyl-acryloylurea，其时间依赖性抑制表明共价作用机制。

这项研究突破性地解决了RNA MTase研究领域的关键技术瓶颈。所开发的MST检测方案不仅灵敏度媲美商业试剂盒，更通过完全公开适配体序列和<0.05美元/反应的成本，极大降低了研究门槛。特别值得注意的是，该方法成功应用于从人源DNMT2到细菌TrmD的多种MTase，展现出广泛的适用性。发现的DNMT2抑制剂为开发靶向tRNA修饰的抗癌药物提供了新起点，而建立的NSUN2稳定化方案则为相关研究扫清了技术障碍。这项工作从方法学创新到实际应用均体现出高度价值，将显著推动RNA表观遗传学和相关药物研发进程。