蓝藻衍生的分子间盐桥稳定光合作用的NDH-1并防止氧化应激

在保守的NdhF1和NdhD1亚基之间，蓝藻衍生的盐桥稳定了光合作用的ndh1复合体，首次揭示了光合作用成分的进化整合如何确保其稳定性。

　　

蓝藻来源的分子间盐桥稳定光合 NDH - 1 并抵御氧化应激研究解读

上海师范大学生命科学学院的研究人员梅正、蒋媛媛等在Communications Biology期刊上发表了题为 “A cyanobacteria - derived intermolecular salt bridge stabilizes photosynthetic NDH - 1 and prevents oxidative stress” 的论文。该研究首次揭示了进化过程中光合组分整合到保守亚基对光合 NDH - 1 稳定性的作用机制，对于理解蓝藻在有氧环境中的生存策略以及复杂生物体的进化具有重要意义，为深入探究光合作用的调控机制提供了新的视角。

研究背景

蓝藻作为地球上最早通过光合作用产生氧气的生物，对地球环境从还原态转变为氧化态起到了关键作用。然而，氧气含量的增加使得蓝藻细胞内不可避免地产生活性氧（ROS），尤其是在环境胁迫条件下，ROS 会对细胞造成损伤。为了应对这一挑战，蓝藻进化出多种抗氧化机制，其中由光合 NDH - 1 介导的循环电子传递（NDH - CET）是一种至关重要的机制。

在光合作用的电子传递过程中，线性电子传递产生的 ATP/NADPH 比值约为 1.29，而 Calvin - Benson - Bassham（CBB）循环需要的比值为 1.5。ATP 的 “捷径” 导致 ATP/NADPH 比值降低，减缓了 CBB 循环，使得电子在光系统 I（PSI）受体侧积累，进而通过电子 - 氧反应产生 ROS。而 NDH - CET 不仅能够产生额外的 ATP，还能提高 ATP 与 NADPH 的比值，促进 CBB 循环，从而减少 ROS 的产生，对蓝藻在有氧环境中的生存至关重要。

维持光合 NDH - 1 结构的稳定性是 NDH - CET 活性的前提，在进化过程中，众多蓝藻来源的亚基整合到光合 NDH - 1 复合物中，以稳定其结构。光合 NDH - 1 复合物位于类囊体膜上，由催化结构域、亲水连接臂和膜嵌入臂组成，分别由特定的蓝藻来源亚基稳定。此外，除了保守的 NDH - 1L，蓝藻还进化出了 NDH - 1L’、NDH - 1MS 和 NDH - 1MS’三种类型的光合 NDH - 1 复合物，以适应不同的环境胁迫。这些复合物都参与 NDH - CET，并共享一个 NDH - 1M 模块，但它们的可变模块包含不同的 NdhD 和 NdhF 亚基，导致 NdhD 和 NdhB 之间的连接不太稳定，容易解离。保守的 NDH - 1L 被认为是原始的光合 NDH - 1 复合物，可能经历了更广泛的环境胁迫，进化出了更多的稳定机制。此前研究虽已发现蓝藻来源的 NdhP 和 NdhQ 亚基以及 NdhF1 和 NdhD1 之间的分子间盐桥，但这些光合组分在进化过程中对保守 NDH - 1 亚基的作用尚未被深入研究。

研究材料和方法

1. 研究材料：本研究以葡萄糖耐受型野生型集胞藻 6803（Synechocystis 6803）及其突变体为材料，包括 ΔndhF1、ndhF1ΔC、ndhF1ΔTM16、NdhF1D635A、NdhF1D635A/ΔndhP、NdhF1D635A/ΔndhQ、ΔndhP/ΔndhQ、ΔndhD1/D2 和 ΔndhB 等突变体菌株。
2. 主要方法和技术路线
   • 突变体构建：通过 PCR 扩增相关基因片段，引入特定的突变和抗性基因盒，再将其连接到载体上，转化野生型集胞藻 6803 细胞，经筛选和纯化获得突变体菌株。例如，构建 NdhF1D635A 突变体时，利用 PCR 技术对编码天冬氨酸的三联体进行定点突变，使其编码丙氨酸。
   • RNA 提取和 RT - PCR 分析：提取总 RNA 后，以 DNase 处理的 RNA 为起始材料，使用 Access RT - PCR 系统进行逆转录和 PCR 扩增，检测相关基因的表达情况。
   • 类囊体膜的分离：收集对数生长期的细胞，经洗涤后，在特定的缓冲液中利用锆石 / 二氧化硅珠涡旋破碎细胞，通过离心去除杂质，最终获得粗类囊体膜。
   • 电泳和免疫印迹：采用蓝色原生 PAGE（BN - PAGE）和 SDS - PAGE 对类囊体膜蛋白进行分离，将蛋白转移到 PVDF 膜上，用特异性抗体检测目标蛋白，以分析光合 NDH - 1 复合物的组装和亚基表达情况。
   • 体外 Fd 依赖的 PQ 还原测定：将野生型集胞藻 6803 的类囊体膜悬浮在特定缓冲液中，加入纯化的 Fd，利用 Dual - PAM - 100 系统记录叶绿素荧光的增加，以此测定体外 Fd 依赖的 PQ 还原活性。
   • 叶绿素荧光和 P700 分析：监测光化光关闭后叶绿素荧光的瞬态增加以及 P700 的氧化还原动力学，评估 NDH - CET 的活性。
   • CO?气体交换动力学测量：将野生型和突变体菌株的细胞悬浮在新鲜 BG - 11 培养基中，经暗处理和光照处理后，使用在线膜入口质谱仪监测 CO?气体交换动力学，计算 CO?吸收速率。
   • ROS 测量：用荧光染料 DCFH - DA 对不同光照条件下生长的细胞进行染色，利用 F4500 荧光分光光度计测量细胞内 ROS 荧光强度。
   • NDH - 1 的同源建模和氨基酸相互作用分析：使用 AlphaFold - Multimer 对 NDH - 1L 复合物的空间结构进行建模，利用 RING v3.0 网络服务器分析 NdhB 和 NdhD 亚基之间的氨基酸相互作用。
   • 统计分析：所有研究至少进行三次独立实验，使用 Windows Excel 进行统计分析，采用双尾 Student's t 检验评估两组数据之间的显著性差异，P 值小于 0.05 被认为具有统计学意义，数据以平均值 ± 标准差表示。
   
   

研究结果

1. Asp635 - Lys166 盐桥稳定光合 NDH - 1：在从古菌到蓝藻的进化过程中，NdhF1 的长水平螺旋上添加了 25 个氨基酸序列。通过序列比对和结构分析发现，蓝藻来源的 Asp635 - Lys166 盐桥形成于 NdhF1 的长两亲性螺旋上的 Asp635 与 NdhD1 的 Lys166 之间。研究人员通过将 Asp635 替换为 Ala635 破坏该盐桥，结果显示，虽然对类囊体膜中光合 NDH - 1 的总蛋白丰度影响较小，但约一半的 NDH - 1L 复合物解聚为常见的 NDH - 1M 模块。通过叶绿素荧光分析和 P700 氧化还原动力学评估 NDH - CET 的体外和体内活性，发现破坏 Asp635 - Lys166 盐桥显著降低了 NDH - CET 的活性。由此得出结论，蓝藻来源的 Asp635 - Lys166 盐桥有助于稳定光合 NDH - 1，其破坏会损害 NDH - CET 活性。
2. Asp635 - Lys166 盐桥防止氧化应激：研究人员测量了高光照射条件下的 CO?固定活性和 ROS 水平。结果表明，在生长光条件下，破坏 Asp635 - Lys166 盐桥的菌株与野生型菌株的 CO?固定活性相似，但在高光条件下，CO?固定活性受到抑制。同时，在生长光条件下，突变体与野生型菌株的细胞内 ROS 水平相似，但在高光照射下，破坏 Asp635 - Lys166 盐桥显著提高了细胞内 ROS 水平。这表明蓝藻来源的 Asp635 - Lys166 盐桥在蓝藻适应高光胁迫过程中，改善了 Calvin - Benson - Bassham 循环，防止了氧化应激。
3. 盐桥和 NdhF1 的 TM16 共同稳定光合 NDH - 1：序列比对和结构数据显示，保守的 NdhF1 亚基包含 16 个跨膜螺旋（TM）和一个超长的水平螺旋（LH）。研究人员推测 Asp635 - Lys166 盐桥与 NdhF1 的 TM16 在 LH 的辅助下，协同稳定类囊体基质侧 NdhD1 和 NdhB 之间的连接。通过截短 NdhF1 的 TM16 和 C 末端尾进行实验，结果与破坏 Asp635 - Lys166 盐桥相似，对光合 NDH - 1 的总丰度影响较小，但导致约一半的 NDH - 1L 复合物解聚为 NDH - 1M 模块，且 NDH - CET 活性降低。由此可知，蓝藻来源的盐桥和 NdhF1 的 TM16 在 NdhF1 的 LH 辅助下，协同稳定类囊体基质侧 NdhB 和 NdhD1 之间的连接，类似于 “cramps iron” 结构。
4. 盐桥与 NdhP、NdhQ 共同稳定光合 NDH - 1：单独删除 NdhP 和 NdhQ 亚基会导致约一半的 NDH - 1L 复合物解聚为 NDH - 1M 模块，与破坏 Asp635 - Lys166 盐桥的结果相似。研究人员在 NdhP 或 NdhQ 缺失突变体中破坏 Asp635 - Lys166 盐桥，结果显示，对类囊体膜中光合 NDH - 1 的总蛋白丰度影响不大，但几乎导致 NDH - 1L 复合物完全解聚为 NDH - 1M 模块。通过体外和体内分析 NDH - CET 活性，发现与单个缺失突变体相比，在 NdhP 或 NdhQ 缺失突变体中破坏 Asp635 - Lys166 盐桥显著降低了 NDH - CET 活性。这表明 Asp635 - Lys166 盐桥与 NdhP、NdhQ 共同稳定光合 NDH - 1 中 NdhD1 和 NdhB 之间的连接。
5. 盐桥与 NdhP、NdhQ 共同防止氧化应激：在高光照射下，与单个缺失突变体相比，在 NdhP 或 NdhQ 缺失突变体中破坏 Asp635 - Lys166 盐桥显著加剧了对 CO?固定活性的抑制。同时，细胞内 ROS 水平在高光照射下显著升高，而在生长光条件下与野生型菌株相似。这说明 Asp635 - Lys166 盐桥与 NdhP、NdhQ 共同增强了蓝藻细胞在适应高光胁迫过程中的 Calvin - Benson - Bassham 循环，稳定了光合 NDH - 1，减轻了氧化应激。

研究结论与讨论

本研究表明，在蓝藻早期进化过程中，为了适应有氧环境和促进新的抗氧化机制，NdhP 和 NdhQ 亚基整合到光合 NDH - 1L 复合物中，它们通过增加 NdhB 和 NdhD1 之间的结合位点，增强了两者之间的连接稳定性。而在此之前，蓝藻在进化过程中还对包括 NdhF1 在内的 11 个保守亚基添加了光合组分。本研究首次揭示了蓝藻来源的 NdhF1 和 NdhD1 两个保守亚基之间形成的分子间盐桥，能够稳定 NdhD1 与 NdhB 的连接。

蓝藻来源的分子间盐桥、NdhF1 的 TM16 和 LH 在类囊体基质侧形成了类似 “cramps iron” 的结构，对稳定光合 NDH - 1 中 NdhB 和 NdhD1 之间的连接至关重要。NdhP 和 NdhQ 则类似于 “分子胶水”，通过增加结合位点，稳定 NdhD1 的构象，增强 NdhB 和 NdhD1 之间的相互作用。尽管盐桥与 NdhP、NdhQ 在稳定 NdhD1 和 NdhB 的相互作用中具有协同作用，但它们的稳定机制存在根本差异。

当蓝藻细胞暴露在高光下时，光合 NDH - 1 复合物促进的循环电子传递速率增加。破坏蓝藻来源的分子间盐桥会使复合物不稳定，可能延长醌还原位点半醌阴离子中间体的寿命，进而产生 ROS。研究发现，暴露在高光下的 NdhF1D635A 突变体中，光合 NDH - 1 复合物的降解程度比在生长光下更大，这支持了上述假设。

综上所述，本研究结合功能数据和先前报道的结构数据，揭示了蓝藻早期进化过程中光合 NDH - 1 介导的抗氧化防御机制。在该机制中，类似 “cramps iron” 的结构以及 NdhP 和 NdhQ 诱导的 “分子胶水” 作用，增强了常见模块 NDH - 1M 与包含 NdhD1 和 NdhF1 的可变模块之间的连接。稳定的光合 NDH - 1 介导的 PSI CET 促进了 ATP 的产生，维持了 ATP/NADPH 比值，优化了 Calvin - Benson - Bassham 循环，减少了高光条件下 ROS 的产生。这种抗氧化机制对早期蓝藻在有氧环境中的生存至关重要，为地球上复杂生物体的进化奠定了基础，为后续深入研究光合作用的稳定性和适应性提供了重要的理论依据。