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在生物技术领域，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是重要宿主，但缺乏强大可靠的正交表达系统。T7 噬菌体 RNA 聚合酶（RNAP）虽常用，在恶臭假单胞菌中却因细胞毒性受限。研究人员构建优化 phi15 表达系统，其诱导倍数达 200 倍，且表达水平提升 20%，为相关研究提供有力工具。
在生物技术蓬勃发展的当下，恶臭假单胞菌作为一种极具潜力的微生物，在合成生物学和工业生物技术领域备受瞩目。它是一种革兰氏阴性土壤定植菌，不仅对细胞外压力具有高度抗性，还拥有多样化的代谢途径，能够被引导用于生产各种具有工业价值的化合物。然而，在其广泛应用的道路上，却存在着一个棘手的问题：缺乏像大肠杆菌那样强大且可靠的正交表达系统。
在大肠杆菌中，T7 噬菌体的单亚基 RNA 聚合酶及其对应的启动子，已广泛应用于从简单的重组蛋白表达，到先进的遗传电路构建和定向进化工具开发等多个合成生物学领域。但在恶臭假单胞菌中，T7 转录机制却遭遇了瓶颈。尽管科研人员探索了多种将 T7 表达系统应用于恶臭假单胞菌的策略，如不同的基因整合位点选择、表达控制方式调整等，但 T7 RNAP 对宿主细胞的毒性问题始终无法得到有效解决，这严重限制了 T7 系统在恶臭假单胞菌合成生物学应用中的全面推广。
为了突破这一困境，来自比利时鲁汶大学（KU Leuven）和丹麦技术大学（Technical University of Denmark）的研究人员 Eveline - Marie Lammens、Daniel C. Volke 等人开展了一项重要研究。他们致力于构建并优化基于噬菌体 phi15 的表达系统，期望为恶臭假单胞菌打造一个高效、可靠的基因表达平台。经过一系列深入研究，他们成功构建了优化的 phi15 表达系统，该系统展现出诸多优势，为恶臭假单胞菌在生物技术领域的应用带来了新的曙光。这项研究成果发表在《Communications Biology》上，为相关领域的研究开辟了新的方向。
研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。在基因操作方面，利用基因组整合技术，将 phi15 RNAP 表达盒稳定整合到恶臭假单胞菌基因组中特定位点，减少拷贝数相关噪音并实现无抗生素培养；采用定点突变技术，对 phi15 RNAP 的核糖体结合位点（RBS）进行改造，降低基础表达水平。在检测分析方面，运用荧光强度测定和生长曲线监测技术，评估不同条件下菌株的荧光表达和生长情况；借助流式细胞术，在单细胞水平分析菌株对诱导剂的响应。
研究结果如下：
- 平衡单拷贝表达提升系统诱导性：研究人员对比了五种常用表达系统驱动 phi15rnap 表达的效果，发现 XylS/Pm 和 LacI/Placlvs系统可显著提高荧光输出。将 phi15rnap 稳定整合到基因组后，位于 PP0013 位点的单拷贝构建体表达水平优于载体系统。进一步替换 RBS 和起始密码子，RBS - D 使系统诱导倍数提高到 25.6，同时维持较高诱导表达水平。
- 引入 phi15 溶菌酶构建严格表达系统：在已优化基础上，将 phi15 溶菌酶（G3RQ）整合到基因组，使系统诱导性从 33 倍分别提升到 107 倍和 70 倍，且基础表达水平与阴性对照无差异，成功构建出严格调控的表达系统。
- 优化表达载体实现高产量表达：研究表明，单拷贝表达构建体对细胞生长影响小且能产生高表达水平。通过在表达载体中添加上下游转录终止子，以及采用基于 phi15 主要衣壳蛋白 5’UTR 序列设计的双顺反子 5’UTR（如 phi15 BCD05），优化后的 pPUT 载体使 GFP 输出比原始载体提高一倍，诱导性达 51.3。
- phi15 gp16 实现生长解耦提高表达量：研究人员筛选出 phi15 gp16 可抑制宿主 RNA 聚合酶，实现生长解耦。在引入 pSTDesR?phi15gp16 后，菌株 P. putida P15 - GD 和 P. putida P15 - LGD 的荧光输出分别比对应菌株提高 43% 和 73%，诱导性显著提升。
- 优化系统响应均一且可调：对四个平台菌株的研究表明，phi15 表达系统响应均一，添加少量诱导剂即可调节，虽在低浓度诱导剂下接近饱和，但与多种诱导剂系统兼容。在单细胞水平，细胞群体对诱导剂响应一致，不同菌株在诱导后不同时间高比例表达 msfGFP。
- 氟酶表达展现系统优势：以氟酶（FlA）表达为测试，与传统表达系统相比，基于 phi15 的 P15 和 P15 - GD 系统使氟酶活性产物 5’ - FDA 产量分别提高 5 倍和 2.5 倍，显示出 phi15 表达系统在异源蛋白表达方面的强大优势。
综上所述，研究人员成功构建并优化了基于 phi15 的表达系统，解决了 T7 系统在恶臭假单胞菌应用中的毒性问题，为恶臭假单胞菌的基因表达调控提供了一套高效、灵活且可靠的工具。该系统在多种实验条件下表现出色，无论是与不同诱导剂系统的兼容性，还是在多种表达模式下的高效性，都彰显了其巨大的应用潜力。这一成果不仅推动了恶臭假单胞菌在生物技术和合成生物学领域的进一步应用，还为其他非模式微生物的基因表达研究提供了重要参考，有望开启微生物基因表达调控研究的新篇章，助力相关领域取得更多创新性突破。
