靶向猪模型早期心肌损伤的介入实时分子MRI

　　

介入实时分子 MRI：猪模型早期心肌损伤精准诊断新突破

在心血管疾病研究领域，德国弗莱堡大学医学中心心脏病学系的 Timo Heidt 等研究人员取得了一项重要进展。他们在npj Imaging期刊上发表了题为 “Interventional real-time molecular MRI for targeting early myocardial injury in a pig model” 的论文。这一研究成果意义非凡，为早期心肌损伤的检测提供了新的方法和思路，有望推动心血管疾病诊断技术的发展，改善患者的预后。

一、研究背景

心肌梗死（MI）和心力衰竭是动脉粥样硬化性血管疾病的致命后果，梗死面积的大小直接决定了心脏功能丧失和不良心脏重构的风险。早期再灌注对于保护心脏功能至关重要，是急性心肌梗死患者治疗的首要目标。在心肌损伤后的愈合过程中，炎症起着关键作用。死亡的心肌细胞会释放危险相关分子模式，激活内皮细胞和血小板，促进先天免疫细胞的募集，以清除坏死碎片，修复或降解受损的心肌细胞。其中，P - 选择素是激活的内皮细胞早期表达的细胞黏附分子之一，在静息状态下存储于亚细胞囊泡中，激活时迅速转移到细胞膜，促进白细胞滚动、黏附和迁移，在血小板中还参与血小板 - 白细胞复合物的形成，增强内皮细胞的附着和迁移。然而，过度的炎症反应可能会增加心肌细胞的清除，对心脏功能产生不利影响。因此，评估炎症活动对于心肌梗死后的心血管风险评估具有重要意义。

磁共振成像（MRI）凭借其出色的软组织对比能力，已成为无创性心肌组织表征的金标准。T2 加权成像、先进的弛豫测量映射技术（T1、T2、T2 * 映射）和对比增强 MRI（晚期钆增强，LGE）等技术，能够检测组织水肿、结构异常（如心肌纤维化或瘢痕形成）。但这些常规 MRI 技术只能间接反映心脏炎症。分子成像作为一种新兴技术，通过将钆或氧化铁与靶特异性受体 - 配体功能化，实现特定对比剂沉积的定位，从而进行组织表征，为提高无创成像工具的诊断能力提供了新途径。此前，分子 MRI 已在多种小动物模型中成功应用，用于靶向动脉粥样硬化血栓形成疾病炎症级联反应中的多种受体，但将该技术应用于大动物模型或患者的转化研究，因灵敏度等问题受到限制。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

研究选用 7 只 3 月龄的幼年家猪（体重 50 - 70 kg），所有实验严格遵循 FELASA 和 GVSOLAS 动物福利标准，经弗莱堡大学当地伦理委员会和弗莱堡地区委员会批准（许可证号 35 - 9185.81/G21/008）。实验前，猪接受肌肉注射咪达唑仑（0.5 mg/kg 体重）和氯胺酮（20 mg/kg 体重）进行预处理，经外周静脉导管注射丙泊酚（2 - 4 mg/kg 体重）诱导麻醉，使用异氟醚（1.5 - 2%）与氧气 / 空气混合气体（）维持麻醉，并静脉注射维库溴铵（0.2 - 0.4 mg/kg 体重 / 小时），每小时给予 5 - 10 ml/kg 体重的林格氏溶液补充液体丢失，静脉注射芬太尼（0.002 - 0.004 mg/kg 体重 / 小时）维持镇痛，通过调整机械通气（IPPV）使各项参数保持在生理范围内，同时监测氧气水平、心电图和二氧化碳浓度。

（二）心肌缺血 / 再灌注损伤模型构建

利用超声引导，将 10 French 动脉鞘插入右股动脉。为降低致命性心律失常的风险，术前补充钾和镁，并静脉注射胺碘酮（10 mg/kg 体重）。使用 C 臂 X 光机和标准冠状动脉导管进行冠状动脉造影，通过注射稀释的碘化造影剂显影左冠状动脉。将带球囊的导管插入回旋支冠状动脉，充气阻断血流 40 分钟诱导缺血，注射造影剂确保血管紧密闭塞。缺血 40 分钟后，放气球囊并移除导管，将实验动物转移至 MRI 设备进行后续检查。

（三）分子对比剂制备

选用粒径为 1 μm 的 MyOneTM Tosyl 活化的 MPIO 颗粒，用 0.1 M 硼酸钠缓冲液洗涤后，重悬于含 200 μg 抗体（小鼠抗猪 P - 选择素抗体或小鼠抗猪 IgG 抗体）的硫酸铵缓冲液中，使最终浓度达到 1 M，在 37 °C 下持续旋转孵育 20 小时。之后，用封闭缓冲液去除残留的活性甲苯磺酰基，将对比剂重悬于储存缓冲液中并持续旋转。

（四）实验方法

1. 体外实验：通过体外流动小室实验评估对比剂与血小板的结合特性，在包被纤维蛋白原的细胞培养皿中加入富含血小板血浆，用 ADP 激活血小板，将对比剂注入平行板流动小室，观察其与血小板单层的结合情况。同时，进行细胞孵育实验，培养猪内皮细胞，将不同对比剂分别与细胞孵育，通过拍照分析对比剂与内皮细胞的结合情况。
2. 体内实验：在临床 3T MRI 系统上进行心脏 MR 成像和 MR 引导的冠状动脉插管。实验动物仰卧，心脏位于磁体中心，使用 32 通道脊柱线圈和 18 通道前胸线圈接收信号，连接四导联心电图进行心脏门控。实验流程包括获取定位图像、进行功能成像（如多切片 2D 电影 bSSFP 序列获取心脏功能和容积信息）、T1、T2 和 T2映射（分别采用不同的序列和参数）、实时 MRI 导管引导（用于冠状动脉插管和对比剂注射）、LGE 成像（静脉注射钆对比剂后进行）。实验结束后，取出心脏固定于 4% 多聚甲醛中至少 7 天，进行离体 3D R2映射成像，并对心脏组织进行免疫荧光染色、苏木精染色，对血液样本进行流式细胞术分析。
3. 数据处理与统计：使用专用的 MRI 后处理软件（CVI 42）对图像进行分析，计算 T2时间、R2值等参数。统计分析采用 GraphPad Prism 软件，结果以均值 ± 标准误表示，两组比较采用 Mann - Whitney U 检验（非参数数据）或 Student's t 检验（参数数据），多组比较采用单因素方差分析（one - way ANOVA），随后进行 Bonferroni 多重比较检验，表示具有统计学意义。

三、研究结果

（一）40 分钟 I/R 诱导的早期损伤仅在心肌 T1 映射中可见

通过在猪的回旋支冠状动脉放置阻塞球囊构建 I/R 模型，缺血通过心电图 ST 段抬高和超声心动图室壁运动异常确认。再灌注 2 小时后进行 MRI 检查，T1 映射显示损伤区域的 T1 时间较远端区域显著延长（），而水肿敏感的 T2 映射未显示出差异（），缺血 4 小时后所有动物均未检测到 LGE，两组左心室射血分数均有相似程度的降低。

（二）心肌缺血后炎症反应迅速

对缺血前后的血液样本进行流式细胞术分析，发现缺血后 3 小时内，促炎性中性粒细胞和炎症性 “经典型” CD14 单核细胞数量立即且持续增加，4 小时达到平台期，而 “非经典型” 单核细胞亚群无明显变化。同时，免疫荧光染色显示心肌损伤区域的白细胞结合整合素 P - 选择素表达较远端心肌组织显著升高（）。

（三）功能化分子成像对比剂可选择性靶向血小板和内皮细胞表达的 P - 选择素

体外实验中，与标记的 IgG 对照相比，P - 选择素对比剂在体外选择性地与内皮细胞结合，并且在流动小室模型中对血小板的结合效率更高（）。

（四）心肌 I/R 中 P - 选择素的体内分子成像

在大动物模型中，利用介入 MRI 将 MPIO 对比剂选择性注入左冠状动脉。注射 P - 选择素 MPIO 后，T2映射显示损伤区域信号降低，R2值显著增加（与 RCA 区域相比，），而对照 MPIO 在损伤区域和非损伤的 LAD 区域均未导致 R2 * 值显著增加。

（五）离体 MRI 和组织学证实对比剂的选择性沉积

实验结束后，对固定的猪心脏进行离体 T2 * 映射成像和组织学分析。结果显示，与灌注但未损伤的 LAD 区域和未灌注的 RCA 区域相比，P - 选择素 MPIO 在损伤区域的信号强度显著增加，组织学切片中 MPIO 颗粒计数也表明，P - 选择素 MPIO 在损伤区域的含量最高，而对照 MPIO 在各区域的结合均较低。

四、研究结论与讨论

本研究表明，通过实时 MRI 引导的介入技术，将靶向炎症早期标志物的分子对比剂选择性注入冠状动脉，能够补充现有 MRI 工具，为缺血性损伤后的组织表征提供更具特异性的信息。研究发现，在 40 分钟心肌缺血再灌注后，T1 映射能够检测到损伤区域的变化，而 T2 映射和 LGE 在早期未显示出改变，这凸显了 T1 映射在检测心脏早期损伤中的高灵敏度，但 T1 改变的原因较为复杂，需要更特异性的信息。炎症早期，血液中先天免疫细胞增加，同时心肌损伤区域 P - 选择素表达升高，非侵入性检测 P - 选择素可作为心脏炎症的早期特异性标志物，但目前对其表达动态变化和对心脏预后的影响了解较少。

研究人员使用共价结合策略，制备了靶向 P - 选择素的 MPIO 对比剂和对照 IgG - MPIO 对比剂。氧化铁化合物因能引起强磁场畸变，适用于对比剂，T2映射或 R2映射可敏感显示铁诱导的磁场畸变，但心脏弛豫测量存在一定挑战，如受运动影响等。研究中通过屏气 bSSFP 协议和后处理运动补偿等方法解决了部分问题。介入 MRI 引导下冠状动脉内注射对比剂的方法，不仅能提高对比剂在感兴趣部位的浓度，还提供了内部对照，但该方法存在一些局限性，如体内 MRI 信号信噪比低、对比剂结合效率低、导管移位等，且冠状动脉内注射对比剂不符合无创成像标准。未来需要通过增强靶特异性结合或使用具有更好靶背景比的对比剂（如氟 - 19）来提高对比剂信号。

总的来说，该研究是一项概念验证研究，证明了基于 MRI 的抗体导向分子成像策略可从啮齿动物模型转化到大动物模型。通过实时 MRI 引导的冠状动脉介入，实现了对炎症早期标志物的靶向成像，为深入理解缺血后心脏损伤提供了新视角，有望为心血管疾病的早期诊断和个性化治疗开辟新途径，具有重要的临床应用前景和研究价值。