软X射线断层扫描揭示TasA缺失对枯草芽孢杆菌生物膜三维结构的调控作用

本研究针对细菌生物膜三维结构解析的技术难题，开发了"毛细管生物膜"生长结合全旋转软X射线断层扫描(SXT)的创新方法，以50 nm等向空间分辨率实现了枯草芽孢杆菌(B. subtilis)生物膜的原位定量分析。研究人员发现TasA蛋白缺失导致细胞定向排列丧失和胞外基质(ECM)结构改变，而外源添加TasA可部分恢复基质密度。该工作为多种生物膜的结构功能研究提供了新范式。

　　

在微生物世界中，细菌很少单独行动——它们更倾向于组建名为"生物膜"的立体社区。这些由胞外基质(ECM)包裹的微生物聚集体，就像是细菌建造的"城市"，既能抵御抗生素攻击，又能通过群体协作获取营养。然而，这座"城市"的精细三维结构一直是个谜团，传统成像技术要么分辨率不足，要么需要破坏性的样品处理。特别是在研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)这类模式微生物时，其生物膜中关键蛋白TasA如何调控整体结构，始终缺乏直观证据。

来自德国马普研究所等机构的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》发表突破性成果。他们巧妙地将生物膜限制在毛细管中生长，结合同步辐射光源的软X射线断层扫描(SXT)技术，首次实现了完整生物膜的三维纳米级成像。这项技术利用"水窗"波段(2.3-4.4 nm)X射线的独特性质，无需染色或固定就能区分细胞器与基质成分，线性吸收系数(LAC)的定量测量还能反映样品化学组成。

研究采用2.5D U-Net机器学习算法进行自动分割，建立了包含单细胞表型、空间排列和ECM密度的系统分析方法。通过比较野生型(WT)和tasA基因缺失株(ΔtasA)，发现WT细胞会沿毛细管形成螺旋状有序排列，而突变体则丧失这种定向性。LAC测量显示ΔtasA的ECM化学密度增加10%，暗示可能存在应激反应导致的胞外多糖(EPS)过量分泌。外源添加TasA蛋白虽能恢复部分ECM结构，但未能重建细胞的有序排列，反而诱导了富含脂质的" punctae"结构形成。

在"Biofilm-in-capillary工作流程"部分，研究者开发了特殊的毛细管培养系统，采用适合脂肽生产的培养基(MOLP)，通过精确控制培养条件获得厚度达200 μm的生物膜样品。全旋转SXT成像在劳伦斯伯克利国家实验室的XM-2显微镜上完成，采用液氦冷却保护样品免受辐射损伤。

"TasA基因缺失导致细胞定向丧失和ECM压缩"部分揭示：WT细胞在22小时培养后呈现明显的链式排列和螺旋构型，而ΔtasA则完全丧失这种有序性。定量分析显示，虽然细胞体积保持约3 μm³不变，但WT细胞的伸长程度(长宽比)在生物膜形成时显著降低。LAC值从悬浮状态的0.14±0.01 μm^-1增至0.16±0.01 μm^-1，提示代谢活动增强。

"补充TasA蛋白可恢复生物膜形态"部分表明：外源TasA能使ΔtasA细胞变得更球形(长宽比从0.19增至0.24)，并出现LAC达0.60 μm^-1的高密度"punctae"。虽然ECM体积恢复13%，但始终未能重建野生型特有的细胞链状结构。

讨论部分指出，这项技术突破了传统成像的局限，首次在近生理状态下揭示TasA的双重功能：既作为ECM的结构支架，又参与细胞代谢调控。发现的"punctae"结构可能反映脂质代谢重编程，为理解生物膜形成中的能量分配提供新线索。该方法可扩展至多菌种生物膜及环境响应研究，为抗生物膜策略开发提供新视角。

这项研究的创新性体现在三个方面：技术上，毛细管培养与SXT的结合开辟了生物膜原位研究新途径；生物学上，明确了TasA在空间组织与化学组成中的双重作用；应用上，建立的分析流程可推广至医疗、环境等领域的生物膜研究。未来通过关联荧光标记等技术，有望进一步揭示生物膜形成中的分子互作网络。