植物纳米颗粒通过塑造人类共生微生物代谢物来增强抗PD-L1的功效

在癌症免疫治疗的背景下，饮食对肠道微生物群和代谢物的影响仍然难以捉摸。在这里，作者揭示了姜源性外泌体样纳米颗粒（GELN） aly-miR159a-3p通过增加微生物依赖的二十二碳六烯酸（DHA）水平从而限制肿瘤细胞PD-L1的表达，从而增强抗PD-L1治疗。

　　

植物纳米颗粒通过塑造人类共生微生物群代谢物增强抗 PD-L1 疗效的研究解读

美国路易斯维尔大学医学院布朗癌症中心的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Plant-nanoparticles enhance anti-PD-L1 efficacy by shaping human commensal microbiota metabolites” 的论文。该研究意义重大，揭示了植物纳米颗粒（PNP）对人类肿瘤免疫治疗的新机制，为改善癌症治疗效果开辟了新途径，有助于推动精准医学发展，为解决癌症免疫治疗中的难题提供了理论依据和潜在策略。

一、研究背景

饮食对肠道微生物群功能影响关键，但饮食成分复杂，难以预测其对肠道微生物群的具体作用。肿瘤会调节微环境逃避宿主免疫反应，免疫疗法虽为癌症治疗带来新希望，但患者对其反应存在差异，肠道微生物组对癌症免疫疗法疗效影响深远，不过饮食 - 微生物组轴影响癌症免疫治疗的潜在机制尚不明确。此前关于饮食影响肠道微生物群功能的研究多聚焦单一因素，忽视了植物纳米颗粒中多种因素的相互作用。植物纳米颗粒（PNP）如外泌体样纳米颗粒（ELN）存在于多种食物中，可调节肠道微生物群活动和宿主生理系统，但 PNP 能否被特定肠道微生物选择性摄取及对细菌代谢产物的调节作用尚未明晰。

二、研究材料和方法

1. 实验动物：选用 6 - 8 周龄雄性特定病原体 - free（SPF）C57BL/6 J 小鼠和 6 - 8 周龄雄性无菌（GF）C57BL/6 J 小鼠。

2. 实验对象：24 名健康志愿者提供粪便样本用于细菌分离，61 名黑色素瘤患者分为 PD-L1 响应组和非响应组。

3. 细胞和细菌：使用 C57BL/6 小鼠黑色素瘤 B16F10 细胞、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。

4. 植物纳米颗粒制备：从生姜、大蒜、芦荟和柠檬中提取 PNP，经差速离心和蔗糖梯度离心纯化，得到 Nano10 和 ELN，并进行表征。

5. 实验方法：包括细菌摄取 PNP 实验、微生物组分析（16S rRNA 基因测序）、代谢组学分析（LC-MS）、RNA 提取和定量实时 PCR、细菌基因敲除、染色质免疫沉淀（ChIP）测定、电子显微镜观察、组织学分析、Western blotting、酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术、单链凝胶迁移试验、表面等离子体共振（SPR）、瞬时转染和荧光素酶报告基因测定等，同时进行定量和统计分析。

三、研究技术路线

研究人员首先从多种食用植物中提取并纯化 PNP，标记后追踪其在体内外被肠道细菌摄取的情况，通过 16S rRNA 基因测序分析摄取 PNP 的细菌种类。接着，对 PNP 的脂质和氨基酸成分进行分析，探究其作为 “eat me”/“don’t eat me” 信号的作用，并通过实验验证。随后，比较 GF 小鼠和 hFB 小鼠在 PNP 处理后的肠道代谢物变化，利用代谢组学数据库分析相关代谢途径。之后，以黑色素瘤小鼠模型为研究对象，探究 PNP 调节肠道细菌代谢物对肿瘤治疗的影响，明确 GELN - RNAs 在其中的作用机制。最后，研究 DHA 增强抗 PD - L1 免疫疗法疗效的机制，以及其与 PD - L1 表达的关系。

四、研究结果

（一）植物来源的纳米颗粒优先被特定的人类肠道细菌家族摄取

研究人员从姜、蒜、芦荟和柠檬中提取并纯化了 PNP，发现其包含 Nano10 和 ELN 两种类型，二者在大小、密度、蛋白质密度和表面电荷等方面存在差异，且这些植物可作为大规模生产 PNP 的来源。通过给健康受试者粪便中分离的细菌以及定植了人类粪便细菌的无菌小鼠喂食荧光标记的 PNP，研究发现不同植物来源的 PNP 均可被人类肠道细菌摄取，但效率不同。进一步研究表明，PNP 可被特定肠道细菌家族优先摄取，且体外和体内环境对 PNP 的摄取选择性有影响，PNP 的摄取效率还与 PNP 类型及植物来源有关。例如，体外实验中，优势摄取 PNP 的细菌家族包括毛螺菌科（Lachnospiraceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）等；体内实验中，不同肠道部位优势摄取 PNP 的细菌家族有所不同 ，且除瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）外，环境因素会影响 PNP 的摄取选择性。

（二）PNP 脂质和氨基酸作为人类肠道细菌的 “Eat me”/“Don’t eat me” 信号

脂质组学分析显示，ELN 和 Nano10 的脂质组成存在显著差异，如 PA 在 ELN 中富集，lysoPG 和 DGDG 在 Nano10 中富集。同时，PNP 膜上的氨基酸组成也有特点，某些氨基酸含量较高，且 ELN 的氨基酸含量总体高于 Nano10。相关性分析表明，PNP 的脂质和氨基酸可作为 “eat me”/“don’t eat me” 信号，影响肠道细菌对 PNP 的摄取。例如，MGDG 富集的 PNP 可作为乳酸杆菌科优先摄取的 “eat me” 信号，而 PI 富集的 PNP 则作为 “do not eat me” 信号防止乳酸杆菌科摄取。通过对特定细菌的摄取实验进一步验证了这些结果，如去除 GELN 中的 DGDG 会显著降低产气荚膜梭菌对其的摄取，而添加 DGDG 则可恢复摄取；去除 AELN 中的 PI 会促进罗伊氏乳杆菌对其的摄取，添加 PI 则恢复抑制作用。

（三）PNP 通过改变人类肠道细菌的代谢物来调节细胞代谢途径

给 GF 小鼠和 hFB 小鼠口服不同类型的 PNP 后，通过 2D - LC - MS/MS 分析发现 PNP 可调节肠道代谢物的组成。不同植物来源的 PNP 对肠道细菌代谢物水平的影响不同，且 ELN 和 Nano10 的作用也存在差异，同时肠道微环境会影响 PNP 对代谢物产生的调节作用。例如，GELN 可在 hFB 小鼠的小肠中显著诱导不饱和脂肪酸（如 EPA 和 DHA）的产生，但在大肠中无此作用，且其他植物来源的 PNP 或 Nano10 也无此效果。通过 KEGG 代谢组学数据库分析发现，ELN 和 Nano10 可能通过调节肠道细菌释放的代谢物来调控人类代谢途径的稳态，如 D - 谷氨酰胺和 D - 谷氨酸（DGG）、精氨酸和脯氨酸（ARP）等途径。对随机选择的代谢物进行 HPLC 分析，结果与高通量 2D - LC - MS/MS 分析一致，进一步证实了 PNP 对细菌代谢物及其调节途径的影响。

（四）GELN RNA 通过抑制小鼠模型中黑色素瘤的生长和转移来调节肠道细菌代谢物活性

以黑色素瘤小鼠模型为研究对象，发现姜来源的 ELN（GELN）或其处理小鼠的肠道代谢物（GELN - Sup）可显著增强抗 PD - L1 疗法对 B16F10 黑色素瘤生长和肺转移的抑制作用，而其他植物来源的 Nano10、ELN 则无此效果。进一步研究表明，GELN - RNAs 在其中发挥了重要作用，其可通过肠道微生物代谢物增强抗 PD - L1 免疫疗法对黑色素瘤进展的抑制作用。例如，用 GELN - RNAs 处理的 hFB 小鼠，其肠道代谢物可恢复 GF 小鼠中抗 PD - L1 疗法的活性，抑制黑色素瘤的生长和肺转移，延长小鼠生存期 ，但在无抗 PD - L1 抗体治疗时，GELN - RNAs 或其肠道代谢物对黑色素瘤肿瘤生长无显著影响。

（五）GELN aly - miR159a - 3p 靶向细菌磷脂酶 C（PLC）导致 DHA 积累

在 GELN 处理的 hFB 小鼠小肠中观察到 EPA 和 DHA 的显著诱导，而 GF 小鼠中无此现象。研究发现，GELN - RNA 可诱导 C. perf 产生 DHA 和 EPA，且 GELN miRNA aly - miR159a - 3p 潜在靶向 PLC。通过 ChIP 测定、qPCR 和 Western blot 分析证实，aly - miR159a - 3p 可抑制 PLC 的表达，从而导致 DHA 积累。例如，ChIP 测定表明 PLC DNA 可被 aly - miR159a - 3p 拉下，qPCR 和 Western blot 分析显示 aly - miR159a - 3p 处理可抑制 PLC 基因的转录和翻译水平，HPLC 分析表明 aly - miR159a - 3p 处理可诱导 DHA 积累并减少 4 - oxo - DHA 的生成。敲除 PLC 基因后，C. perf 中 DHA 水平显著增加，4 - oxo - DHA 水平降低，且 aly - miR - 159a - 3p 对其不再有影响。

（六）DHA 增强黑色素瘤中抗 PD - L1 免疫疗法的疗效

给 B16F10 黑色素瘤小鼠口服 PD - L1 Ab 联合 DHA 或 EPA，结果显示二者均可提高 PD - L1 Ab 对黑色素瘤生长和肺转移的抑制效果，延长小鼠生存期。进一步研究发现，DHA 和 EPA 可抑制肿瘤组织中 PD - L1 的表达，且 DHA 抑制 PD - L1 表达呈剂量依赖性。临床黑色素瘤样本分析表明，PD - L1 表达与 DHA 水平呈负相关，抗 PD - L1 免疫疗法非响应患者的肿瘤组织中 PD - L1 表达较高，DHA 水平较低。将响应和非响应患者的肠道细菌定植到 GF 小鼠中发现，响应患者的肠道细菌（BacResp）可显著提高抗 PD - L1 免疫疗法的疗效，补充 DHA 也有类似效果，且 BacResp 和 DHA 可促进肿瘤浸润 T 细胞产生 IFNγ，减少细胞凋亡，表明 DHA 在改善抗 PD - L1 免疫疗法中起关键作用。

（七）DHA 通过与 PD - L1 启动子区域结合的表观遗传效应抑制 PD - L1 的表达

通过单链凝胶迁移（SSGS）实验、表面等离子体共振（SPR）分析等方法，研究发现 DHA 可与 PD - L1 启动子区域结合，且结合序列为?341 至?358 上游的 AGCCT……ATCAGC。进一步研究表明，DHA 结合到 PD - L1 启动子可抑制其活性，且 c - myc 在其中起重要作用。例如，将小鼠 PD - L1 启动子序列导入荧光素酶报告基因实验表明，DHA 可抑制荧光素酶活性，但对突变体无此作用；敲除 c - myc 基因可消除 DHA 对荧光素酶活性的抑制作用，共转染重组 c - myc 则可恢复其抑制活性。此外，DHA 还可抑制 c - myc 招募到 PD - L1 启动子，从而抑制 PD - L1 的表达，增强抗 PD - L1 免疫疗法的疗效。

五、研究结论与讨论

该研究利用多组学方法，深入探究了 PNP 对人类肠道微生物组及其代谢物的影响。研究表明，PNP 的脂质和氨基酸成分可作为 “eat - me” 和 “don’t - eat - me” 信号，靶向特定肠道细菌种类，影响其代谢活动，进而调节人类代谢途径。同时，PNP 与特定肠道细菌的相互作用有助于调节肠道微生物组的稳态。以 GELN 为例，其通过 aly - miR159a - 3p 抑制细菌 PLC 基因的表达，导致肠道代谢物 DHA 积累，DHA 通过与 PD - L1 启动子结合，抑制 c - myc 介导的 PD - L1 表达，从而增强抗 PD - L1 免疫疗法的疗效。

该研究具有多方面重要意义。在基础研究方面，揭示了饮食来源的纳米颗粒与肠道微生物群相互作用的新机制，为理解肠道微生物群在健康和疾病中的作用提供了新视角；在癌症治疗领域，为改善癌症免疫治疗效果提供了潜在的新策略，有望通过调节肠道微生物群代谢物来提高免疫治疗的响应率；在精准医学方面，有助于推动基于肠道微生物群的精准治疗发展，为个性化治疗提供理论依据。此外，研究还为开发新型纳米颗粒药物递送系统提供了思路，GELN - 衍生的脂质纳米颗粒具有天然健康、低副作用和低环境污染等优势，可作为潜在的药物递送载体。不过，研究也存在一定局限性，如未明确其他类型 PNP 的作用，且未深入探究 PNP 对肠道微生物群中其他成员的影响，未来研究可在此基础上进一步拓展。