基于重力的微滤揭示了卵巢癌和结直肠癌中循环肿瘤细胞团的意外流行

Meunier等人探讨了循环肿瘤细胞（CTC）在卵巢癌和结直肠癌中的群体鉴定。利用优化的基于重力的微过滤捕获动物模型和患者样本中的单个和群集ctc。

　　

重力微过滤技术揭示卵巢癌和结直肠癌中循环肿瘤细胞簇的新发现

在癌症研究领域， McGill University 的 Biomedical Engineering Department 等多部门研究人员取得了重要进展，他们在Communications Medicine期刊上发表了题为 “Gravity-based microfiltration reveals unexpected prevalence of circulating tumor cell clusters in ovarian and colorectal cancer” 的论文。该研究开发的重力微过滤（GμF）技术，为循环肿瘤细胞簇（cCTCs）的研究带来了新突破，有助于深入理解癌症转移机制，对癌症的诊断、预后评估和治疗监测具有重要意义。

一、研究背景

循环肿瘤细胞（CTCs）从肿瘤脱落进入血液，是癌症转移的关键环节，其存在与患者预后不良、复发及耐药相关。CTCs 分为单细胞 CTCs（scCTCs）和多细胞聚集体 cCTCs。cCTCs 虽数量稀少，却具有比 scCTCs 高 23 - 50 倍的转移潜能，在多种癌症患者血液中的存在与不良预后相关 。然而，由于其罕见性、短寿命和易在剪切力下解聚的特性，cCTCs 的分离极具挑战。

上皮性卵巢癌（EOC）五年生存率约 45%，CTCs 在约 10 - 60% 患者血液中被检测到，但 cCTCs 罕见。在结直肠癌（CRC）中，CTCs 也仅在部分患者中可检测到，cCTCs 更是鲜有报道 。现有的 CTCs 分离技术，如基于确定性侧向位移、微流控芯片和基于尺寸筛分的系统等，存在处理时间长、易导致 cCTCs 解离、剪切力高影响细胞完整性等问题。因此，开发高效且温和的 cCTCs 分离技术至关重要。

二、研究材料与方法

（一）材料与试剂

研究中使用的溶液均由 Milli-Q 系统制备的水配制，涉及多种缓冲液、细胞培养试剂、抗体等，从不同供应商获取，用于细胞培养、染色和检测等实验环节。

（二）关键技术路线

1. 微滤器制备：通过标准光刻和深反应离子蚀刻技术制备具有特定孔径（8 - 28μm）的支柱结构，再覆盖 UV 固化聚合物并填充 Fluorolink? MD 700，经 UV 固化、脱模等步骤，制成与 PMMA 环热结合的微滤器 。
2. 过滤 cartridge 制备：利用 AutoCAD 软件设计过滤 cartridge，通过 3D 打印成型，由上下两部分组成，设有放置微滤器的凹槽和密封结构。
3. 重力微过滤（GμF）：GμF 装置由去除柱塞的 60 mL 注射器作为顶部储液器，通过 PEEK 管连接过滤 cartridge。流体柱高度决定压力和流速，实验前对不同流体和过滤器进行流速校准，根据校准曲线调整管长以达到特定流速。
4. 细胞实验：培养卵巢癌 OV - 90 和 OVCAR - 3 细胞系，进行细胞系加标实验，将细胞和细胞簇加入健康人血液样本中。建立卵巢癌原位小鼠模型，收集血液和腹水样本。同时，收集 EOC 患者、结直肠癌肝转移（CRCLM）患者及健康个体的血液样本 。
5. 细胞检测与分析：对过滤后的样本进行细胞染色，通过荧光显微镜观察细胞形态和标记物表达。进行细胞释放实验，评估细胞活力。开展迁移实验和球体形成实验，研究细胞的生物学行为。采用统计学方法分析数据，比较不同实验条件下的差异。

三、研究结果

（一）GμF 对 OV - 90 细胞的捕获特性

1. 流速与捕获效率：研究发现，PBS 稀释的血液和全血样本在 GμF 过滤时，流速先高后低，随后达到稳定。对比 GμF 和泵驱动过滤，GμF 在捕获细胞簇方面更高效，且流速增加会导致细胞簇捕获效率下降，泵驱动过滤对细胞簇的破坏更明显 。
2. 最佳孔径筛选：通过对不同孔径（8 - 28μm）微滤器的测试，发现 15μm 孔径的微滤器能捕获最大范围的细胞簇，且捕获效率较高，同时能有效减少白细胞污染 。
3. 细胞释放与活力：0.1 mL/min 的流速有利于细胞簇的释放且能保持其完整性，细胞簇活力在不同处理条件下稳定在 70 - 80%，高于单细胞活力 。

（二）小鼠血液中 cCTCs 的捕获与分析

1. cCTCs 的捕获与生长：利用 GμF 对卵巢癌原位小鼠模型血液进行过滤，成功捕获 cCTCs，其大小从 2 - 100 + 细胞不等。捕获的 cCTCs 在体外培养时能够增殖和迁移，不同细胞系的 cCTCs 生长行为存在差异 。
2. cCTCs 的分子特征：对小鼠血液和腹水中的 cCTCs 进行染色分析，发现其表达与癌症侵袭性相关的分子标记物，且血液和腹水中的 cCTCs 表型存在差异，支持了 EMT 在 cCTCs 播散中的作用 。

（三）癌症患者血液中 cCTCs 的捕获与分析

1. 患者样本中的 CTCs 分布：对 17 例 EOC 患者和 13 例 CRCLM 患者的血液样本进行分析，发现所有患者血液中均存在 scCTCs 和 cCTCs，不同患者中 cCTCs 的比例和大小分布各异 。
2. 化疗对 CTCs 的影响：对 1 例转移性 EOC 患者进行化疗过程中的动态监测，发现化疗会影响 cCTCs 的数量和大小，cCTCs 数量在化疗第三周期后下降，而 scCTCs 数量在第六周期后才明显下降 。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

1. GμF 是一种高效的 cCTCs 分离方法，利用 8 mm 直径、15μm 孔径的微滤器富集 cCTCs，8μm 孔径微滤器捕获漏过的 cCTCs 和 scCTCs，其高捕获率得益于高孔隙率过滤器、重力驱动流、较大孔径和优化的实验条件。
2. 研究发现 cCTCs 在卵巢癌和结直肠癌患者中普遍存在，此前对 cCTCs 的估计可能因技术限制而偏低。cCTCs 的大小范围广泛，EOC 患者中存在较大的 cCTCs 。
3. 在部分患者中，cCTCs 的数量超过 scCTCs，且 cCTCs 和 scCTCs 可能作为独立于 CA125 的指标，用于评估癌症患者对治疗的反应，为早期诊断和预后评估提供新的依据。

（二）讨论

1. 技术优势与局限性：GμF 相比其他 cCTCs 分离技术，能有效捕获和富集 scCTCs 与 cCTCs，但该研究存在样本量较小、CTCs 鉴定依赖主观免疫荧光分析等局限性。未来需扩大样本量，并结合图像识别和机器学习算法提高检测准确性。
2. 临床应用前景：GμF 在多种癌症患者中成功分离出 cCTCs，显示出其在临床诊断、预后评估和治疗监测方面的潜力。进一步研究 cCTCs 和 scCTCs 在疾病进展中的作用，有助于开发更有效的癌症治疗策略 。

该研究通过 GμF 技术揭示了卵巢癌和结直肠癌患者中 cCTCs 的意外高 prevalence，为癌症转移机制研究提供了新视角，为癌症的诊断和治疗开辟了新方向。未来，随着技术的改进和研究的深入，有望进一步明确 cCTCs 在癌症发展中的作用，推动癌症精准医疗的发展。