重力驱动微滤技术揭示卵巢癌与结直肠癌循环肿瘤细胞簇的意外高发性及其临床意义

本研究针对循环肿瘤细胞簇(cCTCs)在癌症转移中的关键作用但传统分离技术效率低下的问题，开发了重力驱动微滤技术(GμF)。通过优化8-15μm孔径滤膜和0.1 mL/min流速，实现了85%的cCTCs捕获率，并在17例卵巢癌和13例结直肠癌肝转移患者血液中均检测到cCTCs，其中30%患者cCTCs占比超50%。该技术突破了cCTCs检测的技术瓶颈，为癌症转移机制研究和液体活检提供了新工具。

　　

癌症转移是导致患者死亡的主要原因，而循环肿瘤细胞(CTCs)作为癌症转移的"种子"，在血液中的存在与不良预后密切相关。传统观点认为CTCs主要以单细胞(scCTCs)形式存在，但近年研究发现，循环肿瘤细胞簇(cCTCs)虽然数量更少，却具有比单细胞高23-50倍的转移潜能。然而由于cCTCs的脆弱性和稀有性（每毫升血液仅1-10个CTC，其中仅3%为簇状），其分离和检测面临巨大技术挑战。现有技术如Cluster-chip和Parsortix系统存在处理时间长（需4小时处理7.5mL血液）、高剪切力导致簇解离等问题，严重限制了对cCTCs生物学特性和临床价值的研究。

针对这一技术瓶颈，加拿大麦吉尔大学David Juncker团队联合蒙特利尔大学医院研究中心开发了重力驱动微滤技术(GμF)。该技术采用自主开发的20-60%高孔隙率聚合物滤膜和3D打印过滤盒，通过重力驱动实现0.1 mL/min的低剪切流速。研究发现，相比传统泵驱动过滤，GμF将cCTCs捕获率从35%提升至80%，并首次在全部30例癌症患者（包括早期和晚期）血液中检测到cCTCs，其中10例患者cCTCs数量超过scCTCs，颠覆了"cCTCs罕见"的传统认知。相关成果发表在《Communications Medicine》杂志。

关键技术方法包括：1）光刻和深反应离子刻蚀制备8-28μm孔径滤膜；2）重力驱动微流控系统实现0.1 mL/min恒压过滤；3）正交移植小鼠模型（OV-90和OVCAR-3细胞）模拟自发转移；4）免疫荧光染色（CK18/CD45/DAPI）鉴定CTC；5）迁移实验和球体形成实验评估cCTCs生物学特性。临床样本包括17例上皮性卵巢癌（10例高级别浆液性癌和7例其他亚型）和13例结直肠癌肝转移患者血液样本。

Gravity-based microfiltration for selective isolation of clustered CTCs
通过比较重力驱动(GμF)与泵驱动过滤发现：在0.1 mL/min流速下，GμF的cCTCs捕获效率达80%，显著高于泵驱动的35%。有限元分析显示，GμF在22%孔隙堵塞时最大剪切应力(τ_max)仅0.74 Pa，远低于毛细血管的0.5-2 Pa。15μm滤膜可捕获面积达35,000μm²（等效直径90μm）的大簇，且释放后簇面积保持稳定（974±57 vs 795±82μm²）。

Capture of OV-90 cell clusters
系列过滤实验表明，15μm滤膜可捕获75%的cCTCs，同时将白细胞污染从1000个/mL降至200个/mL。反向释放实验证实，1 mL/min高流速会导致59±9%的cCTCs解离为小簇，而0.1 mL/min流速下解离率仅16±7%。

Capture of circulating tumor cell clusters(cCTCs) from mouse blood
在OVCAR-3-GFP小鼠模型中，三组重复实验分别捕获55、40和49个cCTCs，符合泊松分布。cCTCs大小呈连续分布（2-100+细胞），其中2-3细胞簇占27-33%。分离的cCTCs在低粘附培养瓶中7天内面积增长3-8倍（OVCAR-3从1500增至6000μm²）。

cCTCs can help understand dissemination in ovarian cancer
分子表征发现：高侵袭性OV-90来源cCTCs呈现E-cadherin^low/ZO-1^high/ZEB-1^high间质表型，而腹水中的OVCAR-3簇保持E-cadherin^high上皮特征，揭示不同转移途径存在表型异质性。

Capture of cCTCs from cancer patients
临床研究显示：30例患者均检出cCTCs（2-100+细胞），其中高级别浆液性卵巢癌患者OC1的cCTCs占比达71%（62/146个CTC/mL）。结直肠癌肝转移患者中，22%的cCTCs含有白细胞（最高4个WBC/簇）。值得注意的是，4例未化疗的早期患者（OC11、OC12、OC16、OC17）也检出>50细胞的超大簇。

Differential reduction of scCTC and cCTC during treatment
对OC1患者的纵向监测发现：6周期化疗后，CA125从53降至11 U/mL，scCTCs从146降至11个/mL，而cCTCs更早出现下降（62→2个/mL）。化疗后cCTCs平均大小从10.3±2.1降至2.5±0.3细胞/簇，且出现膜起泡等凋亡特征。

该研究通过技术创新解决了cCTCs研究的两大障碍：捕获效率低和样本处理损伤。GμF的三大优势——高捕获率（85%）、低剪切力（0.13 Pa）和短处理时间（5小时）——使其成为目前最温和的cCTCs富集技术。临床发现颠覆了三个传统认知：1）cCTCs存在于所有阶段患者（包括早期）；2）部分患者cCTCs是主要循环形式；3）超大簇（>100细胞）的普遍存在提示集体转移可能比预期更常见。

这些发现为癌症转移机制研究开辟了新视角：cCTCs的高频出现支持"集体播散"假说，而化疗响应差异（cCTCs先于scCTCs减少）提示其可作为疗效预测标志物。未来研究可聚焦于：1）cCTCs分子异质性；2）白细胞嵌入簇的免疫逃逸作用；3）超大簇的机械特性。该技术也有望应用于其他上皮癌的液体活检，推动精准医学发展。