无标记多模态非线性光学显微镜与机器学习：加速生物制药细胞系筛选的新利器

在生物制药领域，筛选高性能细胞系耗时费力。研究人员开展 “利用无标记多模态非线性光学显微镜和机器学习加速生物制药细胞系筛选” 的研究。结果显示该方法能早期区分中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，加速筛选。这为生物制药研发提供新方案。

　　在生物制药蓬勃发展的当下，重组蛋白药物，尤其是单克隆抗体（mAbs），在市场上占据重要地位。而中国仓鼠卵巢（CHO）细胞因其出色的蛋白生产能力，成为生产重组蛋白的首选宿主平台。然而，在利用 CHO 细胞生产重组蛋白的过程中，却面临着诸多挑战。
由于基因随机整合和扩增过程，转染后的 CHO 细胞系克隆存在高度异质性，这使得不同细胞系在产品质量属性（QAs）和工艺性能方面差异巨大。传统的筛选高性能细胞系的方法，如极限稀释法，不仅成本高昂、耗费大量人力，而且极为耗时。同时，早期基于少数质量属性进行的细胞系筛选也存在问题，因为早期培养条件与大规模生产时不同，可能会误将有潜力的细胞系排除在外，或者选到生产能力不佳的细胞系。
为了解决这些难题，来自美国伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校（University of Illinois Urbana - Champaign）等机构的研究人员开展了一项重要研究。他们致力于探究无标记多模态非线性光学显微镜结合机器学习辅助的高内涵分析，能否实现对具有理想生产表型的生物制药 CHO 细胞系的早期识别。最终研究表明，这种集成光学生物成像和机器学习的方法，在早期区分 CHO 细胞系方面极具潜力，能够有效加速细胞系筛选过程，为生物制药研究和开发中细胞系的表征和早期选择提供了新的方向。该研究成果发表在《Communications Biology》上。
在研究方法上，研究人员使用定制的多模态非线性光学显微镜系统，同时采集无标记自发荧光多谐波（SLAM）显微镜和荧光寿命成像显微镜（FLIM）信号，获取细胞的结构和代谢信息。利用机器学习辅助的单细胞分析流程，从单细胞图像中提取多种特征，并对细胞进行分类。实验使用了 4 种具有不同生产表型的工业相关 mAb 生产 CHO 细胞系，涵盖了不同的生产能力和稳定性特征。
下面来看看具体的研究结果：

• 实验设计和 CHO 细胞成像：研究选取了 4 种单一起源的重组 CHO 细胞系 A、B、C、D，它们在生产表型上各不相同，如细胞系 A 的峰值滴度和比生产速率最高，细胞系 B 的峰值滴度最低。研究人员使用自行搭建的多模态非线性光学显微镜，对细胞系在第 0 代、第 1 代和第 2 代进行成像。除了单细胞系孔，还创建了人工细胞系池来模拟细胞系筛选过程。整个数据集包含从 804 个视野中分割出的 27,929 个单细胞。
• 单细胞分析流程和细胞系分类：机器学习辅助的单细胞分析流程包含像素级、对象级和特征级等多个数据处理步骤。利用 Cellpose 深度神经网络分割单细胞，通过 CellProfiler 软件生成 1480 个预工程特征。研究采用了 5 种机器学习分类器（k 近邻算法（kNN）、随机森林（RF）、梯度提升分类器（GBC）、支持向量机（SVM）和多层感知器（MLP））对细胞进行分类，并开发了基于期望最大化的迭代标签细化（EM - ILR）算法来处理人工细胞系池中细胞的不确定标签。
• 交叉验证的细胞系分类结果：无标记多模态非线性光学显微镜在早期区分不同生产表型的 CHO 细胞系方面表现出色。第 1 代和第 2 代的分类性能优于第 0 代，使用全部测试集细胞时，第 1 代和第 2 代的平衡准确率分别提高到 0.952 ± 0.005 和 0.968 ± 0.004，杂质分数显著降低。细胞系 B 在所有三代中敏感性得分最高，细胞系 A 在第 0 代的误分类率相对较高。
• 细胞系分布的可视化：通过 t 分布随机邻域嵌入（t - SNE）等降维技术对不同细胞系在各代的特征进行可视化。结果显示，在第 1 代和第 2 代，细胞系之间的分离更加明显，细胞系 B 具有独特的形态特征，与其他细胞系区分开来。不过，各细胞系内的异质性在各代中均存在，给细胞系差异的视觉识别带来挑战。
• 细胞系分类的特征重要性排名：研究发现相关特征在细胞系分类中起着关键作用，在最优特征集中占比超过 80%。通过排列特征重要性（PIMP）分析，确定了不同代中最重要的特征。例如在第 2 代中，氧化还原比通道的下四分位数强度和 3PF 强度与相量平均寿命的 Manders 重叠系数是重要特征，但这些特征与细胞系生产力和稳定性的生物学关系还需进一步研究。
• 成像模态的重要性排名：不同成像模态对 CHO 细胞系分类的重要性不同。在早期代数中，使用所有成像模态分类性能最佳；在后期代数中，FLIM 单独使用与使用所有模态的分类性能相当，且优于 SLAM。这是因为 FLIM 能够捕捉内源性荧光团的荧光寿命，对细胞代谢活动和分子相互作用更敏感，并且对光照条件变化的耐受性更强。
  在结论与讨论部分，该研究表明无标记多模态非线性光学显微镜与机器学习辅助的单细胞分析技术相结合，在生物制药细胞系表征和筛选方面具有巨大潜力。相关特征在细胞系分类中至关重要，成像模态的选择也会影响分类性能。不过，研究也存在一定局限性，如研究对象仅为特定的用于 mAbs 生产的 CHO 细胞系，分类性能可能需要更大的数据集和更优化的机器学习模型来提升，当前分析流程在计算效率和信息损失方面也有待改进，成像系统的通量也需要提高。但总体而言，该研究为生物制药细胞系的筛选提供了新的思路和方法，有望降低生物制药研发成本，提高药物可及性，并且在干细胞研究、免疫学、癌症生物学等多个领域也具有潜在的应用价值，为深入理解细胞生物学和推动多学科发展奠定了基础。