优化人肺类器官基因转导效率：解锁肺部研究新利器

在人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肺类器官中进行基因转导面临效率低等难题。研究人员优化了慢病毒载体（LVV）转导方法，显著提升转导效率且保留类器官结构。该成果为肺部疾病研究和治疗提供有力工具，推动相关领域发展。

　　在生命科学的探索之旅中，肺部疾病一直是备受瞩目的焦点。人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肺类器官，作为模拟人体肺部结构和功能的 “小宇宙”，为肺部研究带来了新曙光。它能复制人类肺部的关键特征，包括气道样结构以及周围的间充质和其他细胞类型，在研究细胞间相互作用、模拟肺部疾病方面具有独特优势，还被探索用于肺部修复。然而，在利用这些肺类器官深入探究肺部奥秘时，却遇到了 “拦路虎”。
要深入了解肺部疾病发生发展的分子机制，对肺类器官进行基因编辑必不可少。但目前常用的基因递送载体都存在一定问题。腺相关病毒（AAV）虽然常用，但其包装容量有限；腺病毒（Ads）则存在安全隐患。相比之下，慢病毒载体（LVV）凭借能稳定整合到基因组、实现长期基因表达且免疫反应小等优势，成为基因递送的热门选择。不过，将 LVV 高效导入人 iPSC 衍生的肺类器官并非易事。肺类器官复杂的三维结构、异质性的细胞群体以及未成熟细胞的存在，使得传统的 LVV 转导方法效率低下，这严重限制了对肺部疾病的深入研究和相关治疗手段的开发。
为了攻克这一难题，来自加拿大、以色列、中国等多地科研机构的研究人员携手合作。他们致力于优化 LVV 在人 iPSC 衍生肺类器官中的转导方法，旨在提高转导效率，同时保持肺类器官的结构和功能完整性，为肺部疾病研究和治疗开辟新道路。经过不懈努力，他们成功优化出一套高效的 LVV 转导方案，这一成果发表在《Communications Biology》上，为该领域带来了新的希望。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在细胞培养与类器官分化方面，他们利用人 iPSC，通过逐步定向分化方案获得肺类器官，并在特定培养基中培养。基因编辑上，构建携带目的基因的第三代 LVV。为检测转导效果，使用了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）、定量实时 PCR、蛋白质免疫印迹（Western blot）、乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性测定等多种技术，从基因和蛋白水平全面评估。
人 iPSC 衍生肺类器官的特征：研究人员利用 scRNA-seq 和定量 PCR 等技术，对人 iPSC 衍生的肺类器官进行深入分析。结果发现，肺类器官包含七种不同的细胞簇，其中 AT2 样细胞高度表达成人肺 AT2 细胞的多种标记物，如表面活性剂蛋白 B（SFTPB）、表面活性剂蛋白 C（SFTPC）等，这表明所培养的肺类器官在细胞组成和功能上与真实肺部组织具有较高的相似性。
物理和酶解解离的比较：为了找到更合适的方法增加 LVV 转导的表面积，研究人员对比了物理解离和酶解解离对肺类器官的影响。他们发现，物理解离后的肺类器官在培养 7 天后能完全恢复形态，而酶解解离的肺类器官出现边缘粗糙、细胞脱落和膨胀等应激迹象。同时，研究还发现常用的转导增强剂 polybrene 在高浓度下对肺类器官有毒性，这说明物理解离在维持肺类器官结构完整性上更具优势。
LVV 转导的优化：在物理解离的基础上，研究人员进一步优化 LVV 转导条件，采用离心接种（spinoculation）技术。通过对比不同离心速度和时间下的转导效率、细胞毒性和形态变化，发现离心速度为 600g、时间为 60min 时，既能显著提高转导效率，又不会对细胞产生明显的细胞毒性，该条件下的转导效果最佳。
转导后目的蛋白表达和转录组异质性：研究人员构建了携带 eGFP 和 hACE2 基因的第三代 LVV，并将其转导入肺类器官。结果显示，转导后肺类器官的细胞组成未发生明显变化，但在离心接种组中，eGFP 和 hACE2 蛋白表达水平显著高于静态对照组。此外，hACE2 基因在多种细胞簇中的表达均有所增加，且与 eGFP 表达呈正相关，这表明优化后的转导方法能有效实现目的基因的表达。
研究结论表明，研究人员成功开发出一种高效的 LVV 转导方案，在人 iPSC 衍生的肺类器官中实现了目的基因的稳定表达，同时保持了类器官的结构和功能完整性。通过优化转导条件，如物理解离增加表面积、优化培养基提高细胞活力、调整离心接种参数等，显著提高了 LVV 的转导效率。
从讨论部分来看，该研究成果意义重大。一方面，与传统的基因递送方法相比，优化后的方案避免了将三维类器官转化为二维结构带来的弊端，更好地保留了类器官的完整性。另一方面，通过该方法转导后，部分之前被认为是未分化的肺泡 II 型细胞，因 hACE2 的高表达得以清晰识别，这有助于提高 scRNA-seq 在鉴定细胞表型方面的敏感性和特异性。总之，该研究为肺部疾病的研究提供了更强大的工具，有望推动肺部疾病机制研究和治疗方法的创新发展，让我们在攻克肺部疾病的道路上迈出了坚实的一步。