谁先到的？白色念珠菌和铜绿假单胞菌双生物膜的优先效应

白色念珠菌和铜绿假单胞菌的多微生物生物膜表明，受接种顺序影响的优先效应影响生物膜的组成、结构、毒力和抗菌敏感性。

　　

探究白色念珠菌与铜绿假单胞菌双物种生物膜中的优先效应：对感染治疗的新启示

来自巴塞罗那科学技术研究所生物工程研究所（Institute for Bioengineering of Catalonia, IBEC）以及巴塞罗那大学（University of Barcelona）的研究人员 Betsy V. Arévalo-Jaimes、Joana Admella 和 Eduard Torrents，在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Who arrived first? Priority effects on Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa dual biofilms” 的论文。该研究首次全面地阐述了白色念珠菌（Candida albicans）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在双物种生物膜中的优先效应，对于理解肺部感染机制以及制定针对性治疗策略具有重要意义，为解决临床上面临的多微生物感染难题提供了新的思路和理论依据。

一、研究背景

在人体的多种微生态环境中，真菌和细菌的共同定植极为常见，由此引发的跨界多微生物感染广泛存在于口腔、胃肠道、皮肤、呼吸道和泌尿道等部位。白色念珠菌作为最常见的真菌病原体，经常与各类细菌群落发生相互作用。而且，大多数人类感染性疾病是由能够在生物表面和医疗器械上形成生物膜的病原体所导致，白色念珠菌在其中表现出很强的生物膜形成能力，既可以单独形成，也能与其他微生物共同形成。

白色念珠菌和铜绿假单胞菌频繁地从皮肤、肺部感染以及医疗器械相关感染的生物膜中被共同分离出来。它们之间的相互作用主要表现为拮抗关系，涉及复杂的物理和化学机制。尽管如此，二者形成的多微生物生物膜却呈现出更高的毒力和更强的抗微生物耐药性，这凸显了微生物群落的复杂性和动态性。在肺部共同感染中，白色念珠菌在疾病进展过程中的作用尚不明确，目前也缺乏足够的临床证据来支持在检测到白色念珠菌后进行抗真菌治疗。

微生物生态学研究表明，群落组装过程中的历史进程，如物种到达的顺序和时间，会对物种间的相互作用产生显著影响，这种 “优先效应” 在哺乳动物肠道和皮肤微生物群落以及真菌 - 细菌生物膜中均有体现。然而，在白色念珠菌和铜绿假单胞菌的双物种生物膜中，优先效应的作用仍然知之甚少。因此，探究该优先效应对于深入理解微生物感染机制和制定有效治疗策略至关重要。

二、研究材料与方法

（一）实验菌株

研究选用了两株临床分离株，分别是从菌血症患者体内获取的白色念珠菌 10045727，以及从患有持续性感染的囊性纤维化患者体内分离得到的铜绿假单胞菌 PAET1。在成像实验中，使用了表达 GFP 质粒 pETS - PA 的铜绿假单胞菌 PAET1。

（二）生物膜形成

将白色念珠菌和铜绿假单胞菌 PAET1 分别在 30°C 的酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基和 37°C 的 LB 培养基中过夜培养（16 小时，200 转 / 分钟）。经离心、洗涤后，用含 L - 谷氨酰胺、无碳酸氢钠且添加 0.2% D - 葡萄糖的 RPMI - 1640 培养基（RPMId）调整菌悬液的浓度，使白色念珠菌的 OD550 = 0.1，铜绿假单胞菌的 OD550 = 0.005，对应约 10 CFU/mL。

在 96 孔聚苯乙烯平底培养板中，依据不同的定植顺序构建三种多微生物生物膜：先接种白色念珠菌，6 小时后接种铜绿假单胞菌（1Ca2Pa）；先接种铜绿假单胞菌，6 小时后接种白色念珠菌（1Pa2Ca）；同时接种两种菌（CaPa）。以白色念珠菌和铜绿假单胞菌的单微生物生物膜作为对照（Ca 和 Pa）。为促进细胞黏附，初始接种（t0）时的 RPMId 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS），第二次接种（t1）前用 PBS 洗涤。生物膜在 37°C 孵育 48 小时，期间 24 小时更换一次培养基。通过超声和涡旋处理使生物膜脱离，进行系列稀释后在 LB 和 YPD 琼脂平板上培养，以测定 CFU 数量来量化生物量。

（三）显微镜观察

利用表达 GFP 的铜绿假单胞菌 PAET1 和用 Calcofluor White 染色的白色念珠菌，在 8 孔细胞培养载玻片上形成多微生物生物膜，载玻片提前用 FBS 预处理过夜以增强黏附。使用蔡司 LSM 800 共聚焦扫描激光显微镜观察成熟生物膜，用 Propidium Iodide 染色死细胞，用 ConcanavalinA - AlexaFluor647 染色细胞外基质多糖，并用蔡司软件处理图像。

（四）毒力评估

选用 A549 肺腺癌细胞系评估早期生物膜的毒力。A549 细胞在含 10% FBS、100 单位 /mL 青霉素 / 链霉素和 2.5 μg/mL 两性霉素 B 的 DMEM/F12 培养基中培养，在湿度为 5% CO2、温度为 37°C 的培养箱中传代和维持。

在进行活力实验时，将 2×10^5 个 A549 细胞 / 孔接种于 24 孔板中，孵育 24 小时后更换为不含抗生素和抗真菌药物的 DMEM/F12 培养基（仅含 10% FBS）。第三天，用含 10% FBS 和 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 DMEM/F12 培养基替换培养基，然后用约 10^5 CFU/mL 的各微生物感染 A549 细胞，形成不同的多微生物生物膜。设置未感染的 A549 细胞、感染铜绿假单胞菌 PAET1（Pa1x）和感染白色念珠菌（Ca1x）的细胞作为对照，同时设置接种浓度加倍的单微生物生物膜（Ca2x 和 Pa2x）对照。感染 4 小时后（t01）用 PBS 洗涤，继续培养至 24 小时（t1）。

用胰蛋白酶 - EDTA 消化 A549 细胞，经台盼蓝染色后在 Neubauer 计数板上计数活细胞数量，计算细胞活力。通过比较感染孔和对照孔中活细胞数量的对数值来计算细胞活力的降低值。同时，处理感染后的细胞以回收附着的细菌和真菌，通过超声、涡旋和系列稀释后在 LB 和 YPD 琼脂平板上计数菌落数量。

（五）药敏评估

选用美罗培南（MER，5 μg/mL）、卡泊芬净（CAS，5 μg/mL）、N - 乙酰半胱氨酸（NAC，1 mg/mL）以及它们的组合（MER + CAS、NAC + MER、NAC + CAS、MER + CAS + NAC）评估多微生物生物膜的抗菌药敏性。每种生物膜条件均设置用 RPMId 处理的对照孔。在 t1 接种 24 小时后进行处理，15 小时后洗涤生物膜并按照生物膜形成实验中的方法进行 CFU 定量，通过对照样本和处理样本的 CFU/mL 对数值之差计算生物量的减少量。

（六）统计分析

使用 GraphPad Prism v10 进行绘图和统计分析。根据实验数据的特点，采用非配对 t 检验、单向方差分析或双向方差分析评估不同条件下均值的统计学差异，必要时进行多重比较校正。构建多元线性回归模型解释感染的 A549 真核细胞活力降低的变化，设定 p < 0.05 为具有统计学意义。

三、研究结果

（一）不同接种时间的白色念珠菌和铜绿假单胞菌 PAET1 生物膜的组成和结构

通过 CFU 计数发现，当铜绿假单胞菌 PAET1 作为早期定植菌（1Pa2Ca）时，其生物量（CFUs/mL）显著高于其他多微生物条件（1Ca2Pa 和 CaPa）和单微生物对照（Pa），在 1Pa2Ca 条件下其相对丰度达到 97.75%。然而，多微生物生物膜的总 CFUs/mL 在不同条件下并无显著差异。

显微镜观察结果与 CFU 计数相符，在 1Pa2Ca 条件下可见更多的细菌细胞。无论接种顺序如何，铜绿假单胞菌 PAET1 均能侵入白色念珠菌生物膜并到达表面，但在不同条件下其在生物膜层中的分布有所不同。当铜绿假单胞菌 PAET1 先接种时，会形成致密的底层，覆盖大部分非生物表面，限制白色念珠菌的附着；当白色念珠菌先接种时，细菌底层较薄，但在生物膜各层中的分布更广泛，表明其利用白色念珠菌作为附着的生物表面；当两种菌同时接种时，种内聚集现象更明显，导致白色念珠菌和铜绿假单胞菌层重叠，且白色念珠菌死亡率升高，生物膜更薄。

（二）不同接种时间的白色念珠菌和铜绿假单胞菌 PAET1 生物膜的毒力评估

在 A549 肺泡细胞上形成早期生物膜（20 - 24 小时）评估毒力。结果显示，在 1Pa2Ca 条件下形成的生物膜中，铜绿假单胞菌 PAET1 的生物量显著高于其他多微生物生物膜。虽然三种多微生物生物膜的总 CFUs/mL 无显著差异，但在 A549 细胞存在的情况下，生物膜的组成发生了变化。

通过台盼蓝染色评估 A549 细胞活力，发现所有单微生物生物膜均使细胞活力降低约 0.1 - 0.4 log10，多微生物生物膜中，同时定植（CaPa）的生物膜使细胞活力降低程度与单微生物对照相似（0.35 log10 A549 细胞 /mL）。而顺序定植的生物膜中，先接种铜绿假单胞菌（1Pa2Ca）使细胞活力降低 0.63 log10，先接种白色念珠菌（1Ca2Pa）使细胞活力降低 1.07 log10，1Ca2Pa 条件成为所有测试条件中毒力最强的。

多元线性回归模型表明，铜绿假单胞菌 PAET1 的 CFUs/mL、白色念珠菌的 CFUs/mL 以及两者的相互作用均对 A549 细胞活力有显著影响（r2 = 0.9918），即两种微生物的生物量增加均与 A549 细胞死亡率升高相关。

（三）不同接种时间的白色念珠菌和铜绿假单胞菌 PAET1 生物膜的治疗反应

评估生物膜对常规抗菌药物 15 小时治疗的反应。美罗培南（MER）对 1Ca2Pa 和 1Pa2Ca 生物膜中的铜绿假单胞菌 PAET1 的作用与单微生物对照相似，但在 CaPa 条件下其敏感性降低。白色念珠菌在所有多微生物生物膜中对卡泊芬净（CAS）的敏感性均低于单微生物对照。联合使用 MER 和 CAS 可恢复 CaPa 生物膜中铜绿假单胞菌的敏感性，但对白色念珠菌的敏感性无改善。

添加 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）后，消除了多微生物和单微生物生物膜中铜绿假单胞菌 PAET1 和白色念珠菌敏感性的差异。NAC 对单微生物和多微生物生物膜中的铜绿假单胞菌 PAET1 具有抗菌作用，且在联合治疗中作为佐剂可显著提高对多微生物生物膜中铜绿假单胞菌和白色念珠菌的清除效果（≥1 log10 CFUs/mL），但单独使用时对白色念珠菌的抗真菌活性不明显。

四、研究结论与讨论

本研究全面表征了白色念珠菌和铜绿假单胞菌双物种生物膜中的优先效应，为理解多微生物感染机制和治疗策略提供了重要依据。

从结构方面来看，优先定植的微生物在表面定植上具有优势，这会改变生物膜群落的组成。如 1Pa2Ca 条件下，铜绿假单胞菌 PAET1 优先定植，减少了白色念珠菌的附着位点，使生物膜以细菌为主导；而 1Ca2Pa 条件下，虽然白色念珠菌比例增加，但铜绿假单胞菌 PAET1 凭借较小的细胞尺寸和附着于真菌结构的能力，在数量上仍占优势，这也突出了白色念珠菌作为生物膜支架的重要作用。

在毒力方面，顺序定植显著增强了对 A549 肺泡上皮细胞的毒力，尤其是 1Ca2Pa 条件最为明显。这表明在实际感染中，病原体的感染顺序对疾病的严重程度可能有重要影响，且多微生物生物膜的毒力不仅取决于单个微生物的负荷，还与两种微生物生物量之间的相互作用密切相关。尽管未深入探究 1Ca2Pa 生物膜毒力增强的具体机制，但已有研究表明白色念珠菌可诱导铜绿假单胞菌毒力因子的产生和生物膜形成，可能是导致这一现象的原因。

在治疗反应上，研究发现多微生物生物膜中微生物对抗生素和抗真菌药物的敏感性受到优先效应的影响。例如，CaPa 条件下铜绿假单胞菌对美罗培南的敏感性降低，而联合使用抗生素和抗真菌药物（MER + CAS）在顺序定植的生物膜中并未表现出协同作用。此外，P. aeruginosa PAET1 的细胞外基质对白色念珠菌在卡泊芬净治疗中的保护作用不受定植顺序影响，但添加 NAC 可消除这种保护作用，显著提高治疗效果。

该研究的重要意义在于，明确了白色念珠菌在铜绿假单胞菌肺部感染中可能扮演的积极角色，这与以往认为白色念珠菌在呼吸道感染中仅为定植菌的观点不同。同时，验证了 N - 乙酰半胱氨酸在治疗白色念珠菌和铜绿假单胞菌共同感染中的潜在价值，其不受优先效应影响，为临床治疗提供了新的选择。然而，本研究仅使用了每种物种的单一分离株，未来的研究需要纳入更多菌株，以进一步验证这些结论。此外，采用动态模型在流动条件下评估优先效应，以及延长生物膜生长时间来评估毒力和治疗效果，将有助于更深入地理解这两种微生物之间的相互作用，为临床治疗多微生物感染提供更全面、更可靠的理论支持。