人肠道产毒素大肠杆菌双突变热不稳定毒素皮内注射的安全性和免疫原性

　　

肠毒素性大肠杆菌双突变热不稳定毒素皮内注射人体安全性与免疫原性研究解读

在全球范围内，肠毒素性大肠杆菌（ETEC）引发的腹泻疾病负担沉重，然而，目前尚无获得许可的疫苗用于预防。美国马里兰大学医学院疫苗开发与全球健康中心及儿科学系的 Marcela F. Pasetti 等研究人员，在npj Vaccines期刊发表了题为 “Safety and immunogenicity in humans of enterotoxigenic Escherichia coli double mutant heat-labile toxin administered intradermally” 的论文。该研究针对 ETEC 双突变热不稳定毒素（dmLT）开展，对开发预防 ETEC 腹泻的有效疫苗具有重要意义，为后续疫苗研究和开发提供了关键依据，有望推动针对 ETEC 及其他肠道病原体疫苗的发展。

一、研究背景

ETEC 是导致腹泻的主要细菌病原体，对全球公共卫生构成严重威胁，尤其影响生活在资源匮乏地区的幼儿、部署到流行地区的士兵和旅行者。由于缺乏许可疫苗，寻找安全有效的预防和控制措施迫在眉睫。

针对 ETEC 热不稳定肠毒素（LT）等毒力因子的疫苗研发备受关注。早期研究中，口服霍乱疫苗添加霍乱毒素 B 亚单位（CTB）能诱导产生针对 LT 的交叉反应抗体，对 ETEC 腹泻有一定保护作用。后来，经皮贴片递送的天然 LT 毒素作为 ETEC 疫苗在实地试验中显示出有限的保护效果，但也发现 LT 免疫有减轻腹泻严重程度的潜力。不过，天然 LT 的反应原性和肠毒性限制了其作为疫苗的应用，促使研究人员开发解毒变体，dmLT 便是其中之一。

此前研究表明，dmLT 经口服和舌下给药具有一定安全性，但免疫原性较低且不稳定。皮内（ID）接种途径因在其他疫苗（如甲型肝炎、季节性流感等）应用中展现出优势，被认为可能是 ETEC 疫苗的有效递送途径。已有研究显示，ETEC 的 CfaE 菌毛尖端黏附素皮内接种联合减毒单突变 LT 能引发强烈免疫反应，且 dmLT 作为佐剂能增强其他疫苗的免疫效果，这些前期研究为本次研究奠定了基础。

二、研究材料与方法

（一）研究设计

这是一项单中心、门诊、随机、双盲、安慰剂对照的 1 期剂量递增研究，旨在评估 dmLT 作为潜在 ETEC 候选疫苗皮内注射的安全性和免疫原性。研究于 2016 年 7 月开始招募，2020 年 5 月结束。

（二）参与者

招募 18 - 45 岁健康男性和非孕妇女性，排除患有乙肝、丙肝、HIV 感染，近期接受过相关疫苗接种、抗生素治疗，有药物滥用史，以及曾感染霍乱或腹泻性大肠杆菌，或近期去过 ETEC 流行地区的人群。

（三）随机化与盲法

利用 SAS 软件进行随机化分组，采用置换区组随机化方法，根据不同队列设置不同的分配比例。研究人员、受试者、数据录入人员和实验室人员均对治疗分配不知情，仅特定人员持有治疗密钥，以确保研究的盲法实施。

（四）疫苗

ETEC dmLT 由沃尔特?里德陆军研究所（前 4 个队列）和 IDT Biologika Dessau（第 5 队列）生产，符合 cGMP 规范。使用前用无菌注射用水复溶，再用 0.9% 生理盐水稀释至合适剂量，通过皮内注射给药。

（五）研究流程

研究设置 4 个递增剂量组（0.1、0.3、1.0 和 2.0μg），每组多次免疫，部分队列接受安慰剂。疫苗在制备后 15 分钟内于三角肌皮内注射，受试者接种后需在诊所观察至少 30 分钟。

（六）样本采集与检测

在不同时间点采集血清、粪便和淋巴细胞上清液样本。通过 ELISA 检测血清和粪便中的抗体，用改良的检测方法测定 LT 毒素中和抗体，对淋巴细胞上清液中的抗体也进行 ELISA 检测，以此评估免疫反应。

（七）数据分析

安全性分析纳入所有接受至少一剂研究产品的受试者；免疫原性分析针对符合方案人群，计算抗体反应的百分比、几何平均倍数增长（GMFR）和几何平均滴度（GMT），并通过 Spearman 相关性和广义估计方程（GEE）分析免疫反应生物标志物之间的相关性。

三、研究结果

（一）参与者情况

共 246 人接受筛选，100 人被纳入研究，随机分为 7 个队列，各队列在性别、种族、年龄等方面无显著差异。大部分参与者完成了免疫接种和随访，各队列在不同时间点的随访留存率有所差异。

（二）安全性

所有剂量的疫苗均安全且耐受性良好。常见的 solicited 不良事件多为轻度，主要是局部注射部位反应（如硬结、红斑、压痛、疼痛）和胃肠道相关的全身反应（如腹痛、腹泻、厌食）。有 9% 的受试者出现中度治疗相关 unsolicited 不良事件，1 人出现严重不良事件，但均与疫苗无关。值得注意的是，dmLT 接种者注射部位出现高色素沉着，且呈剂量依赖性，持续时间较长，但不引起症状，仅影响美观。

（三）抗体反应

1. 血清抗体：除 0.1μg 剂量组外，其他 dmLT 队列在首次接种后 21 天大多实现了 IgG 血清转化，1.0μg 和 2.0μg 剂量组在接种后能诱导较高的 IgG 和 IgA 血清转化，且多次接种 2.0μg dmLT 的队列在 6 个月后仍保持较高的血清转化。血清 IgA、IgG 和 LT 中和抗体的 GMFR 在高剂量组和多次接种组中更高。
2. 淋巴细胞上清液抗体：多数接受 dmLT 的受试者产生了 ALS IgG 和 IgA 反应，且高剂量组和多次接种组的反应率和 GMFR 更高。
3. 粪便抗体：黏膜 IgA 诱导水平较低，接受 2.0μg dmLT 三次接种的参与者中，不到一半出现粪便 IgA 阳性反应，不同剂量和接种次数的组间存在差异，安慰剂组也有部分参与者出现阳性反应。

（四）免疫终点关联

通过 Spearman 相关性分析和 GEE 分析发现，血清 IgA 与 ALS IgA、LT 中和抗体，血清 IgG 与 ALS IgG、LT 中和抗体之间在多数队列中存在显著相关性，表明不同免疫反应之间存在内在联系。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

本研究表明，dmLT 皮内注射作为潜在的 ETEC 候选疫苗具有良好的耐受性和免疫原性。所有剂量水平和接种方案均安全，高剂量（2.0μg）且多次接种（至少两次）能诱导强烈且持久的免疫反应，包括产生高滴度的血清 IgG、IgA 和 LT 中和抗体，以及激活疫苗特异性 B 细胞产生 ALS IgG 和 IgA 反应。

（二）讨论

1. 安全性方面：疫苗引发的不良反应多为轻度，局部高色素沉着虽持续时间长，但不影响健康，可能是毒素引发的局部炎症反应。与其他研究中 LT 相关的皮肤反应类似，这为进一步理解疫苗的局部反应机制提供了参考。
2. 免疫原性方面：与其他研究相比，dmLT 皮内注射诱导的 IgG 和 IgA 反应频率相似，且能产生持久的 LT 中和抗体，这对阻断毒素与宿主组织结合和细胞病变效应具有重要意义。不同免疫反应之间的相关性为优化未来疫苗研究的检测指标提供了依据。
3. 研究局限性：不同队列样本采集随访时间不同，影响了低剂量组免疫持久性的评估；目前缺乏 ETEC 保护的相关指标，dmLT 皮内注射的保护效力有待确定；dmLT 作为单一疫苗或佐剂预防 ETEC 及其他肠道感染的效果也需进一步研究。
4. 未来展望：尽管存在局限性，但该研究的安全性和免疫原性结果令人鼓舞，为进一步研究 dmLT 皮内注射作为 ETEC 疫苗抗原，以及在联合疫苗和佐剂方面的应用提供了有力支持，有望为预防 ETEC 腹泻和其他肠道感染带来新的突破。

Marcela F. Pasetti 等人的这项研究在 ETEC 疫苗研发领域迈出了重要一步，为后续研究指明了方向，随着研究的深入，有望开发出更有效的 ETEC 疫苗，减轻全球腹泻疾病负担。