o -糖基转移酶C1GALT1促进EWSR1::FLI1的表达，是尤文氏肉瘤的治疗靶点

Ewing肉瘤（ES）是由致癌融合蛋白EWSR1::FLI1驱动的。在这里，作者发现半乳糖转移酶C1GALT1稳定Smoothened蛋白，激活Hedgehog信号并促进ES细胞中EWSR1::FLI1的转录，这可能是抗真菌药物伊曲康唑抑制C1GALT1的治疗靶点。

　　

揭示尤文肉瘤治疗新靶点：C1GALT1 的关键作用

美国马萨诸塞大学陈医学院（University of Massachusetts Chan Medical School）的研究人员在Nature Communications杂志上发表了题为 “The O-glycosyltransferase C1GALT1 promotes EWSR1::FLI1 expression and is a therapeutic target for Ewing sarcoma” 的论文。该研究意义重大，为尤文肉瘤（Ewing sarcoma，ES）的治疗提供了全新的潜在靶点和治疗策略，有望改善 ES 患者的预后。

一、研究背景

尤文肉瘤是一种侵袭性骨癌，主要发生于儿童和年轻人，目前的治疗方法包括强化化疗、放疗和 / 或手术，但对于转移性或复发性疾病的治疗进展有限，5 年生存率仅为 20 - 30%，且尚无获批的靶向疗法。尤文肉瘤的特征是染色体易位，产生致癌融合蛋白 EWSR1::FLI1，它对肿瘤细胞的生存和生长至关重要，是极具潜力的治疗靶点。然而，EWSR1::FLI1 作为转录因子缺乏酶活性，传统小分子抑制剂难以对其进行靶向治疗，因此寻找促进 EWSR1::FLI1 表达的可成药靶点成为研究的关键方向。

二、研究材料与方法

1. 细胞系与培养：使用多种细胞系，包括 A673、SK-N-MC、IMR-90、NIH 3T3、HepG2、TC-32、TC-71 和 TC-106 等，在不同的培养基中培养，并添加相应的血清、抗生素等，确保细胞正常生长。通过转染、感染等方式构建稳定表达特定基因或蛋白的细胞系，如构建 A673/EWSR1::FLI1-tdTomato/EGFP/Cas9 报告细胞系用于后续实验。
2. CRISPR/Cas9 筛选：利用 CRISPR/Cas9 技术构建报告细胞系，用 Brunello 人 CRISPR 敲除混合慢病毒文库转导细胞，经嘌呤霉素筛选、荧光激活细胞分选（FACS）和深度测序，识别促进 EWSR1::FLI1 表达的基因。
3. 基因编辑与干扰：运用 CRISPR 基因编辑技术敲除特定基因，如 C1GALT1；通过 shRNA 和 siRNA 技术分别实现稳定和瞬时的基因敲低，研究基因功能。
4. 检测方法：采用定量 RT-PCR 检测基因表达水平；免疫印迹分析检测蛋白表达；染色质免疫沉淀测定（ChIP）分析蛋白与 DNA 的结合；GLI 报告基因检测 Hh 信号通路活性；O - 糖基化测定分析蛋白的 O - 糖基化修饰等。
5. 动物实验：将细胞接种到 NOD-scid IL2Rgammanull（NSG）小鼠体内，构建肿瘤模型，观察肿瘤生长情况；对小鼠进行药物处理，评估药物疗效；通过免疫组化分析肿瘤组织中相关蛋白的表达。

三、研究技术路线

1. 构建报告细胞系：利用 CRISPR/Cas9 介导的同源定向修复，将 tdTomato cDNA 等元件构建到 A673 细胞的 EWSR1::FLI1 基因位点，再导入 Cas9 和 EGFP 表达质粒，构建出 A673/EWSR1::FLI1-tdTomato/EGFP/Cas9 报告细胞系。
2. CRISPR/Cas9 筛选促进 EWSR1::FLI1 表达的基因：用 Brunello 文库转导报告细胞系，筛选出 tdTomatolow EGFPhigh 的细胞群体，经深度测序和数据分析，确定候选基因，再通过敲低实验验证。
3. 研究 C1GALT1 对 EWSR1::FLI1 的影响：对 C1GALT1 进行基因敲除、敲低实验，使用药物抑制其活性，检测 EWSR1::FLI1 及相关蛋白和基因的表达变化。
4. 探究 C1GALT1 影响 EWSR1::FLI1 的机制：研究 C1GALT1 与 Hh 信号通路的关系，以及对 SMO 的 O - 糖基化修饰和稳定性的影响。
5. 验证 C1GALT1 在细胞转化和肿瘤生长中的作用：通过软琼脂集落形成实验、动物肿瘤形成实验，验证 C1GALT1 对细胞转化和肿瘤生长的影响。
6. 评估 ITZ 对 ES 细胞和肿瘤的作用：用 ITZ 处理 ES 细胞系和小鼠肿瘤模型，检测细胞活力、肿瘤生长及相关蛋白表达，探究 ITZ 的作用机制和疗效。

四、研究结果

（一）全基因组 CRISPR/Cas9 筛选确定促进 EWSR1::FLI1 表达的因子

研究人员构建了表达 Cas9 和 EGFP 的 A673/EWSR1::FLI1-tdTomato 报告细胞系，用包含约 76,000 个 sgRNAs 的 Brunello 文库进行转导筛选。经嘌呤霉素筛选、FACS 分选和深度测序，确定了约 70 个候选基因，从中选取排名前 20 的基因进行验证。最终鉴定出 9 个促进 EWSR1::FLI1 表达的因子，包括 C1GALT1，且敲低这些因子可降低 EWSR1::FLI1 的 mRNA 水平。

（二）O - 半乳糖基转移酶 C1GALT1 在 ES 细胞中高表达，其遗传或药理抑制降低 EWSR1::FLI1 水平和功能

CRISPR/Cas9 敲除 A673 细胞中的 C1GALT1 可消除 EWSR1::FLI1 表达，shRNA 敲低 C1GALT1 或其伴侣蛋白 C1GALT1C1 也有类似效果。此外，敲低 C1GALT1 影响 EWSR1::FLI1 靶基因的表达。免疫组化显示，C1GALT1 在 ES 肿瘤中高表达，在正常组织中不表达，且高表达与患者总生存期降低相关。FDA 批准的抗真菌药物伊曲康唑（ITZ）可抑制 C1GALT1，处理 A673 细胞后，EWSR1::FLI1 的 mRNA 和蛋白水平呈剂量依赖性降低，同时影响其靶基因表达，且排除了 ITZ 通过抑制 CYP51A1/CYP3A4 影响 EWSR1::FLI1 表达的可能性。

（三）EWSR1::FLI1 表达受 Hh 信号通路促进

ITZ 可抑制 Hh 信号通路，该通路在胚胎发育和癌症发展中起重要作用。研究发现，敲低 A673 细胞中 Hh 信号通路的关键成分 SMO、GLI1 或 GLI2，或用相应抑制剂处理，可降低 EWSR1::FLI1 的 mRNA 和蛋白水平；相反，用 Hh 激活剂 SAG 处理则可增加其表达。ChIP 实验表明，GLI1 和 GLI2 可结合到 EWSR1 启动子区域，敲除部分结合位点会降低 EWSR1::FLI1 表达，说明 Hh 信号通路直接促进 EWSR1::FLI1 表达，且二者存在反馈调节。

（四）C1GALT1 刺激 ES 细胞中的 Hh 信号通路

敲低 A673 细胞中的 C1GALT1 或用 ITZ 处理，会降低 SMO 和 GLI1 的 mRNA 和蛋白水平，抑制 Hh 信号通路活性，减少 GLI1 和 GLI2 与 EWSR1 基因的结合。在 NIH 3T3 细胞中异位表达 C1GALT1，可增加 SMO 和 GLI1 水平，促进 Hh 信号通路活性，表明高表达的 C1GALT1 可刺激 Hh 信号通路。

（五）C1GALT1 促进 ES 细胞中 SMO 的 O - 糖基化和稳定

通过凝集素下拉实验和免疫共沉淀实验，证实 SMO 是 C1GALT1 的靶蛋白，在 ES 细胞中发生 O - 糖基化且与 C1GALT1 相互作用。抑制 C1GALT1 活性会降低 SMO 的 O - 糖基化水平和稳定性，使 SMO 半衰期缩短，且 SMO 的 O - 糖基化缺陷突变体表达水平低，易通过蛋白酶体和 / 或溶酶体途径降解，说明 C1GALT1 介导的 SMO O - 糖基化增强了其稳定性。

（六）C1GALT1 是 EWSR1::FLI1 介导的细胞转化所必需的

在 A673 细胞中，敲低 C1GALT1 或 SMO 显著降低细胞在软琼脂中的集落形成能力和在小鼠体内的成瘤能力，且肿瘤组织中相关蛋白表达减少，细胞增殖能力降低。在 NIH 3T3 细胞中，敲低 C1GALT1 或 SMO 可抑制 EWSR1::FLI1 介导的细胞转化，而异位表达 C1GALT1 可通过刺激 Hh 信号通路使 NIH 3T3 细胞发生转化，且该转化作用依赖于 SMO。

（七）ITZ 抑制人 ES 细胞系的增殖并抑制 ES 异种移植瘤在小鼠体内的生长

在表达高水平 C1GALT1 的 ES 细胞系中，敲低 C1GALT1 或用 ITZ 处理可抑制 Hh 信号通路和 EWSR1::FLI1/ERG 表达，降低细胞活力，诱导细胞凋亡。ITZ 对 ES 细胞的抑制效果优于传统 SMO 抑制剂，且其作用主要通过抑制 C1GALT1 介导的 Hh 信号通路实现。在小鼠 ES 异种移植瘤模型中，ITZ 处理显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤组织中相关蛋白表达，且该抑制作用可被异位表达的 EWSR1::FLI1 抵消，表明 ITZ 通过抑制 C1GALT1 影响 ES 肿瘤生长。

五、研究结论

本研究通过全基因组 CRISPR/Cas9 筛选，发现 C1GALT1 可促进 ES 细胞中 EWSR1::FLI1 的表达。C1GALT1 通过 O - 糖基化修饰 SMO，稳定 SMO 蛋白，激活 Hh 信号通路，进而促进 EWSR1::FLI1 表达，形成正反馈调节。抑制 C1GALT1，无论是通过基因编辑还是使用 ITZ 等药物，均可降低 SMO 的 O - 糖基化水平，抑制 Hh 信号通路和 EWSR1::FLI1 表达，减少 ES 细胞活力，抑制肿瘤生长。该研究揭示了一种促进 EWSR1::FLI1 表达和 ES 肿瘤生长的可治疗靶点机制，为 ES 的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。

六、研究讨论

（一）C1GALT1 在 ES 中的作用机制

此前研究表明 C1GALT1 在多种癌症中发挥作用，本研究明确在 ES 中其主要靶点可能是 SMO，但不排除它通过糖基化其他底物促进肿瘤生长的可能性。ES 细胞对 SMO 的持续需求可能与 SMO 使 SUFU 失活、促进 GLI 转录因子入核有关。

（二）ITZ 的作用及优势

ITZ 作为一种已获批的抗真菌药物，可通过抑制 C1GALT1 间接作用于 SMO，影响 Hh 信号通路和 EWSR1::FLI1 表达。与传统 SMO 抑制剂相比，ITZ 在 ES 细胞中表现出更高的疗效，且 ES 细胞对传统 SMO 抑制剂的相对不敏感可能与 C1GALT1 诱导的 SMO 糖基化有关，这为 ES 治疗提供了新的方向。

（三）临床应用前景

ITZ 在动物实验中的有效剂量在临床抗真菌治疗中可达到，且前期临床研究表明其对基底细胞癌有一定疗效。因此，针对 ITZ 单药或与其他 Hh 通路拮抗剂联合治疗 ES 的临床试验值得开展，有望为 ES 患者带来更有效的治疗方案，改善患者的预后。

综上所述，该研究发现 C1GALT1 在尤文肉瘤发生发展中的关键作用，为开发新的治疗策略提供了重要理论依据和潜在靶点，ITZ 作为治疗尤文肉瘤的药物具有一定的临床应用前景，值得进一步深入研究。