苏丹埃博拉病毒糖蛋白与其人内体受体NPC1复合物的低温电镜结构

苏丹埃博拉病毒识别人类NPC1的结构基础不仅为苏丹病毒，而且为整个埃博拉病毒属提供了对受体结合、细胞进入、组织趋向性和宿主范围的关键见解。

　　

探秘苏丹埃博拉病毒与宿主受体的结合机制：结构生物学视角下的突破

近期，美国明尼苏达大学医学院药理学系等单位的研究人员在Communications Biology期刊上发表了题为 “Cryo-EM structure of Sudan ebolavirus glycoprotein complexed with its human endosomal receptor NPC1” 的论文。该研究聚焦苏丹埃博拉病毒（Sudan ebolavirus，SUDV），解析了其糖蛋白与人类内体受体 NPC1 的复合物冷冻电镜结构，为理解埃博拉病毒属的受体识别、细胞进入机制等提供了关键见解，在病毒学研究领域意义重大。

一、研究背景

埃博拉病毒属是丝状病毒科的一部分，包含五种不同病毒，其中四种可感染人类。蝙蝠被认为是埃博拉病毒的自然宿主，但至今尚未从蝙蝠或其他动物中分离出完整的病毒。在这五种病毒里，埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）最为常见，导致的人类死亡人数最多；苏丹病毒（SUDV）次之，也对全球健康和国家安全构成严重威胁，其近期在乌干达爆发的疫情，病死率接近 50%。目前，针对 EBOV 已有获批的疫苗和治疗方法，然而 SUDV 却缺乏相应对策，且其与内体受体 NPC1 的结构相互作用仍不明确，这限制了对其感染性、组织嗜性和宿主范围的评估，也阻碍了相关疫苗和治疗手段的研发。

埃博拉病毒的糖蛋白（glycoprotein，GP）在病毒进入宿主细胞过程中起关键作用。GP 以同源三聚体形式组装在病毒表面，由受体结合亚基 GP1 和膜融合亚基 GP2 组成。在病毒成熟过程中，三聚体 GP 在 GP1/GP2 连接处被弗林蛋白酶切割，但 GP1 和 GP2 仍通过二硫键和非共价相互作用连接。GP1 亚基包含受体结合位点（receptor-binding site，RBS），起初被聚糖帽和粘蛋白样结构域（mucin-like domain，MLD）覆盖。病毒进入细胞时，GP1 先与非特异性细胞表面因子结合，通过内吞作用进入细胞。在内体中，内体蛋白酶去除聚糖帽和 MLD，暴露出 RBS，RBS 进而与内体膜上的 NPC1 受体结合，随后 GP2 发生构象变化，促使病毒膜与内体膜融合，将病毒基因组释放到宿主细胞胞质中。NPC1 是埃博拉病毒的内体受体，对病毒进入细胞至关重要。此前研究解析了 EBOV GPcl 与全长人类 NPC1 的冷冻电镜结构，以及 EBOV GPcl 与 NPC1-C 的晶体结构，但 SUDV 与 NPC1 的结构相互作用尚未得到实验表征，不同埃博拉病毒序列变异对其与人类 NPC1 结合亲和力的影响也不清楚。

二、研究材料与方法

（一）细胞系与质粒

研究使用了 HEK293T 细胞和 Expi293F 细胞。前者用于伪病毒生产，在添加了 10% 胎牛血清、2 mM L - 谷氨酰胺、100 单位 /mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养；后者用于蛋白表达，在 Expi293 表达培养基中培养。实验所用的 SUDV GP、EBOV GP 和人类 NPC1 基因均由 GenScript 合成，相关基因分别被克隆到特定载体中，用于后续实验。

（二）蛋白表达与纯化

将编码 EBOV GP-ΔM、SUDV GP-ΔM 和人类 NPC1-C 的质粒，利用聚乙烯亚胺（PEI）瞬时转染到 Expi293F 细胞中。转染三天后收集上清液，通过 Ni-NTA 柱和 Superose200 凝胶过滤柱对 GP-ΔM 蛋白进行纯化。使用嗜热菌蛋白酶 L 将 GP-ΔM 消化为 GPcl，再经 Superose200 凝胶过滤柱进一步纯化。人类 NPC1-C 蛋白则通过 Strep-Tactin XT 柱和 Superose200 凝胶过滤柱进行纯化。

（三）表面等离子共振（SPR）

利用 Biacore S200 系统，通过 SPR 技术测定重组 GPcl（来自 EBOV 或 SUDV）与重组人类 NPC1-C 的结合亲和力。将重组 GPcl 通过化学交联固定在 CM5 传感器芯片上，以不同浓度（1.25 μM 至 20 μM）的人类 NPC1-C 在特定缓冲液中注入，使用 Biacore Evaluation Software 分析数据。

（四）伪病毒细胞进入测定

通过共转染 HEK293T 细胞制备 SUDV 伪病毒，转染质粒包括编码全长 SUDV GP 的 pcDNA3.1 (+) 质粒、编码 HIV 骨架的辅助质粒 psPAX2 和报告质粒 plenti-CMV-luc。收获伪病毒后，用嗜热菌蛋白酶 L 处理使其 GP 裂解为 GPcl，再用于感染瞬时表达全长人类 NPC1 的 293 T 细胞。48 小时后裂解细胞，加入荧光素酶底物，使用 EnSpire 酶标仪测量相对光单位（RLUs），以此评估 SUDV 伪病毒的进入效率。

（五）冷冻电镜数据收集、处理、模型构建与精修

将 SUDV GPcl 和人类 NPC1-C 按 1:4 的摩尔比混合并稀释至 0.3 mg/mL，取 4 μL 混合物滴加到铜网上，经处理后在液氮乙烷中快速冷冻。使用配备特定探测器和能量过滤器的 300 kV FEI Titan-Krios 透射电子显微镜采集图像，用 cryoSPARC v4.5.1 软件处理数据，以 5F1B 为起始模型在 Coot-0.8.9 中进行初始模型构建，在 Phenix-1.16 中进行精修，并结合 Coot-0.8.9 中的手动调整。

三、研究结果

（一）SUDV GPcl 与人类 NPC1 的结合

研究人员表达并纯化了 SUDV GPΔM、EBOV GP-ΔM 和 hNPC1-C，经蛋白酶解得到 SUDV GPcl 和 EBOV GPcl。通过 SPR 测量发现，SUDV GPcl 和 EBOV GPcl 与 hNPC1-C 的解离常数（Kd）分别为 2.41 μM 和 20.4 μM，表明 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 的结合力约为 EBOV GPcl 的九倍。

（二）SUDV GPcl 与人类 NPC1 复合物的结构

冷冻电镜解析出 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 复合物的结构，分辨率达 3.31 ?。结构显示，三聚体 SUDV GPcl 有两个拷贝的 hNPC1-C 与之结合。对比 SUDV GPcl/hNPC1-C 复合物和 EBOV/hNPC1-C 复合物的结构，发现二者整体结合模式相似，但 SUDV RBS 与 hNPC1-C 的结合界面存在关键差异。在 SUDV RBS/hNPC1-C 界面，Loop 1 发生显著构象变化，相比 EBOV RBS/hNPC1-C 界面，Loop 1 远离 RBS 超过 6 ?，这主要由 SUDV RBS 中 S142Q 的残基变化导致，Gln142 较大的侧链推开了 Loop 1，使 EBOV RBS 中存在的主链堆积相互作用在 SUDV RBS 中消失，因此 Gln142 不利于 hNPC1-C 结合。虽然 hNPC1-C 的 Loop 2 在两个界面构象相似，但由于 RBS 区域残基差异，具体相互作用不同。在 SUDV RBS/hNPC1-C 界面，Pro148 与 hNPC1-C 的 Asp502 形成疏水堆积相互作用，Ala141 因较小的疏水侧链远离 Tyr423 的极性羟基，且与 Ile79 形成有利的疏水相互作用，这些变化都增强了 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 的结合。

（三）结构数据的生化验证

为验证结构数据，研究人员进行了两项生化实验。一是通过 SPR 实验检测 hNPC1-C 与多种 SUDV GPcl 变体的结合情况，这些变体包含从 SUDV RBS 到 EBOV RBS 的残基突变（I79V、A141V、Q142S、P148A 及 A141V/Q142S/P148A 三重突变）。结果显示，I79V、A141V 和 P148A 突变降低了 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 的结合亲和力，Q142S 突变则增加了结合亲和力，A141V/Q142S/P148A 三重突变也降低了结合亲和力。二是进行 SUDV 伪病毒进入实验，使用含有相同突变的 SUDV GPcl 构建伪病毒感染表达 hNPC1 的人类细胞。结果表明，I79V、A141V 和 A141V/Q142S/P148A 突变减少了 SUDV 伪病毒进入，Q142S 突变增强了进入，P148A 突变有减少进入的趋势，但结果无统计学意义。这些生化实验结果与结构数据相符，表明 SUDV 和 EBOV GPcl 之间的残基差异通常有利于 SUDV GPcl 与 hNPC1 结合，除了残基 142。

四、研究结论与讨论

本研究发现 SUDV GPcl 与人类 NPC1 的结合力比 EBOV GPcl 强约九倍，RBS 区域中只有四个残基（79、141、142 和 148）的差异是 SUDV GPcl 具有更强受体结合亲和力的关键决定因素。通过冷冻电镜结构解析，明确了这四个 RBS 残基变化在与 hNPC1-C 结合中的结构作用。生化实验进一步验证了结构发现，表明这些残基差异影响病毒与受体的结合及病毒进入细胞的过程。较高的 NPC1-C 结合亲和力可能使 SUDV 更容易进入细胞，甚至感染 NPC1 表达较低的组织，但病毒的感染性和组织嗜性还受其他多种因素影响。

对埃博拉病毒属中五种病毒的 RBS 区域序列分析显示，只有本研究中检测的四个残基在不同病毒间存在变异。基于 hNPC1-C 结合亲和力，SUDV 最高，RESTV 最低，这可能解释 RESTV 对人类缺乏致病性，但埃博拉病毒的发病机制复杂，该发现需进一步实验验证。此外，研究还对埃博拉病毒的动物起源和宿主范围进行了探讨。此前研究表明，蝙蝠 NPC1 中的 D502F 突变使其难以被 EBOV GPcl 识别，可能是蝙蝠的一种进化适应。本研究发现，在 SUDV RBS / 蝙蝠 NPC1 界面，Phe502 可与 Pro148 形成疏水相互作用，而 EBOV RBS 中无法形成这种相互作用，这为之前关于埃博拉病毒潜在宿主范围的研究提供了分子解释。

这项研究不仅加深了对 SUDV 受体结合、细胞进入、组织嗜性和宿主范围的理解，还推动了对整个埃博拉病毒属受体结合的认识。其为开发针对 SUDV 及其他埃博拉病毒的治疗方法和疫苗提供了重要结构基础，有助于评估病毒的传播风险和潜在宿主范围，对公共卫生防控具有重要指导意义。未来研究可在此基础上，进一步探索其他影响埃博拉病毒感染性和致病性的因素，以及开发更有效的干预措施。