Jagged1在促进或抑制乳腺肿瘤形成中的亚型特异性作用

　　

Jagged1 在乳腺癌发生中的亚型特异性作用研究解读

美国密西西比大学医学中心细胞与分子生物学系的研究人员 Wen-Cheng Chung、Wei Wang、Lavanya Challagundla 等，在《Oncogenesis》期刊上发表了题为 “Subtype-specific role for Jagged1 in promoting or inhibiting breast tumor formation” 的论文。该研究明确了 Jagged1 在正常乳腺发育和不同乳腺上皮细胞来源肿瘤形成中的作用，为乳腺癌的精准治疗提供了新的理论依据和潜在靶点，在乳腺癌研究领域具有重要意义。

一、研究背景

乳腺癌是一种异质性疾病，基于基因表达谱可分为多种分子亚型，包括管腔 A 型、管腔 B 型、HER2 富集型、基底样型、Claudin 低表达型和正常乳腺样型。Notch 信号通路在乳腺癌的发生发展中起重要作用，其功能具有两面性，既可以作为癌基因促进肿瘤生长，也可以作为抑癌基因抑制肿瘤发生 。Jagged1 是乳腺中表达最丰富的 Notch 配体，然而其在乳腺中的功能尚不清楚。已有研究表明，Jagged1 在乳腺癌中的作用复杂，在不同细胞系中的表现各异，如在管腔型乳腺癌 MCF-7 细胞中敲低 JAG1 会增加肿瘤球生长和癌症干细胞活性，而在三阴性乳腺癌 SUM149 细胞中敲低 JAG1 则显著限制肿瘤类器官的生长 。此外，KRAS 是人类恶性肿瘤中最常发生突变的基因之一，在部分 ER 阴性乳腺癌中存在 KRAS 及其负调节因子 NF1 的突变，RAS 通路激活在乳腺癌的起始和进展中发挥重要作用，且致癌性 Ras 可激活 Notch 信号，Notch 对维持 Ras 转化的人类细胞的肿瘤表型至关重要。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

实验使用的小鼠品系包括由 Dr. Freddy Radtke 和 Dr. Nicholas Gaiano 分别提供的 Jag1 和 TNR 小鼠，以及从 Jackson Laboratory 和 NCI Mouse Repository 获得的 MMTV-Cre、PB-Cre4、Sox9-CreER、p53、KrasLSL-G12D、RosaLSL-lacZ 和 Rosa 等品系。对部分小鼠进行特定处理，如给 4 - 5 周龄的雌性 p53;KrasG12D;Sox9CreER 和 Jag1loxP/loxP;p53loxP/loxP;KrasG12D;Sox9-CreER 小鼠连续 3 天腹腔注射他莫昔芬（62.5mg/Kg 体重）。动物饲养在标准条件下，实验方案经相关机构动物护理和使用委员会批准。

（二）实验技术

1. 全组织染色和 X-gal 染色：收获小鼠腹股沟乳腺进行全组织苏木精染色或 X-gal 染色，X-gal 染色时，乳腺固定后经蔗糖饱和、包埋，切片染色并复染。
2. 流式细胞术：用胶原酶 / 透明质酸酶溶液解离小鼠乳腺组织制备单细胞悬液，经谱系富集试剂盒处理后，用多种抗体染色，通过 BD LSR-II 流式细胞仪检测荧光，用 FlowJo 9.1 软件分析。
3. 组织学和免疫组化：乳腺组织固定、石蜡包埋切片，经抗原修复后用多种抗体染色，用尼康显微镜观察拍照。
4. 蛋白质免疫印迹分析：匀浆裂解小鼠乳腺组织，提取总蛋白定量后进行 SDS-PAGE 电泳，用相应抗体检测特定蛋白。
5. 药物处理和 MTS 检测：从 p53;KrasG12D;PB-Cre4 小鼠乳腺肿瘤建立细胞系，用恩杂鲁胺处理细胞，用 MTS 法检测细胞活力。
6. 定量逆转录 PCR：提取总 RNA 并逆转录为 cDNA，进行 PCR 反应，以 Gapdh 为内参，分析 Hey1 和 Hey2 基因表达。
7. 人类乳腺癌数据集分析：从 GEO 数据库下载转录组水平基因表达数据集 GSE96058，用 R 软件进行分析，包括 ANOVA 检验、生存分析和相关性分析等。

三、研究技术路线

研究人员首先构建了多种小鼠模型，通过在不同细胞类型中删除 Jagged1 基因，结合基因编辑技术（如 Cre-loxP 系统），精准调控 Jagged1 在乳腺上皮细胞、肺泡细胞、雄激素响应性管腔细胞、乳腺干细胞和管腔祖细胞中的表达。利用多种实验技术，如染色技术观察组织形态和细胞标记物表达，流式细胞术分析细胞亚群，蛋白质免疫印迹和定量逆转录 PCR 检测基因和蛋白表达水平，药物处理结合细胞活力检测评估肿瘤细胞生长，以及对人类乳腺癌数据集进行生物信息学分析，全面探究 Jagged1 在正常乳腺发育和肿瘤形成中的作用机制。

四、研究结果

（一）MMTV-Cre 介导的 Jagged1 缺失导致处女小鼠乳腺干细胞积累和管腔分化缺陷

通过 MMTV-Cre 在处女小鼠乳腺上皮细胞中删除 Jagged1 基因，X-gal 染色显示 MMTV-Cre 介导的删除几乎发生在所有乳腺上皮细胞。与对照组相比，Jag1loxP/loxP;MMTV-Cre 乳腺组织中 Jagged1 mRNA 水平降低 60%。通过与转基因 Notch 报告基因（TNR）小鼠杂交发现，Jagged1 缺失导致 eGFP 细胞数量减少，表明 Notch 报告基因激活降低，且这种降低局限于邻近的基质和管腔细胞。同时，Jagged1 突变的乳腺显示富含乳腺干细胞的 CD24+CD49fhiCD61+Sca1-1 群体扩张，而终末分化的管腔细胞数量减少。突变腺体中雌激素受体 -α（ERα）表达正常，但管腔区孕酮受体（PR）表达显著降低，这一结果通过免疫组化和蛋白质免疫印迹分析得到证实。尽管管腔分化存在缺陷，但 Jagged1 缺失对导管形态发生影响不明显。

（二）怀孕期间删除肺泡细胞中的 Jagged1 不影响泌乳分化或泌乳后退化

Jagged1 在怀孕早期在肌上皮细胞中表达，中期至晚期在肺泡细胞中上调，泌乳期下调，泌乳后退化开始时再次上调。利用 WAP-Cre 在肺泡细胞中删除 Jagged1，对泌乳第 10 天的乳腺进行全组织制备和组织学分析，发现 Jag1loxP/loxP;WAP-Cre 小鼠与 WAP-Cre 对照组相比，肺泡和泌乳分化正常。此外，该突变体在泌乳后退化以及随后怀孕中的肺泡 / 泌乳分化也正常。

（三）Jagged1 抑制雄激素响应性管腔细胞来源的乳腺肿瘤发展

利用 PB-Cre4 转基因系构建小鼠模型，发现 PB-Cre4 可在前列腺上皮细胞中指导 Cre 表达，在雌性 p53loxP/loxP;KrasG12D;PB-Cre4 小鼠中，其在成熟管腔细胞中导致 p53 缺失和 KrasG12D 表达，形成的肿瘤 ERα 和 PR 染色阴性或弱阳性，AR 染色阳性，类似于人类 AR + 三阴性乳腺癌。将 Jag1loxP/loxP 与 p53loxP/loxP;KrasG12D;PB-Cre4 模型杂交后，显著加速了乳腺肿瘤的发展，缩短了中位无瘤生存期。免疫组化和蛋白质免疫印迹分析表明，Jagged1 在 p53loxP/loxP;KrasG12D;PB-Cre4 小鼠的管腔细胞中有表达，而在 Jag1loxP/loxP;p53loxP/loxP;KrasG12D;PB-Cre4 小鼠中缺失。同时，Jag1loxP/loxP;p53loxP/loxP;KrasG12D;PB-Cre4 肿瘤中 Notch 靶基因 Hey1 表达降低，Hey2 未检测到，提示 Jagged1 在雄激素响应性管腔细胞中起肿瘤抑制作用，Hey1 是 Jagged1 介导的 Notch 信号下游的转录靶点。

（四）Jagged1 促进乳腺干细胞和管腔祖细胞来源的乳腺肿瘤发展

先前研究表明高表达 JAG1 与基底样乳腺癌不良预后相关。利用 Sox9-CreER 构建小鼠模型，Sox9 表达细胞在乳腺中可作为所有成熟谱系和管腔祖细胞的前体。Sox9-CreER 介导的 p53 缺失和 KrasG2D 诱导可导致乳腺肿瘤形成，肿瘤分化差，ER 阴性，PR 阳性细胞少，含有纺锤形间充质样细胞。将 Jag1loxP/loxP 与 p53loxP/loxP;KrasG12D;Sox9-CreER 模型杂交后，显著抑制了乳腺肿瘤的形成。与 p53loxP/loxP;KrasG12D;Sox9-CreER 小鼠的肿瘤相比，Jag1loxP/loxP;p53loxP/loxP;KrasG12D;Sox9-CreER 小鼠的肿瘤中纺锤形细胞少，有一定程度的腺体分化。免疫组化和定量逆转录 PCR 分析显示，Jag1loxP/loxP;p53loxP/loxP;KrasG12D;Sox9-CreER 肿瘤中 Hey2 蛋白和 mRNA 表达降低，提示 Jagged1-Notch-Hey2 信号促进了基底样乳腺肿瘤从乳腺干细胞和 / 或管腔祖细胞的发展。

（五）高 JAG1 表达与基底亚型乳腺癌患者生存率差相关，但与 ER+PR-HER2 - 肿瘤患者生存率好相关

在小鼠实验中，删除 Jagged1 对不同细胞类型来源的肿瘤发展有相反影响。在人类乳腺癌中，高 JAG1 表达与基底亚型患者生存率差相关，而与 ER+PR-HER2 - 肿瘤（管腔 B 亚型的一个亚组）患者生存率好相关。JAG1 表达与 HEY1 和 HEY2 表达呈正相关，高 HEY2 表达与基底亚型乳腺癌患者生存率差相关，高 HEY1 表达与管腔 A 亚型患者生存率好相关。管腔 B 亚型中 JAG1、HEY1 和 HEY2 基因表达低于其他亚型。

五、研究结论与讨论

研究表明，Jagged1 在乳腺上皮细胞层次结构中起着重要的调节作用。在处女小鼠乳腺中，Jagged1 缺失导致乳腺干细胞积累和管腔分化缺陷，影响 PR 表达，可能对乳腺癌的发生发展产生重要影响，尤其是在 ER + 肿瘤中。在怀孕期间，肺泡细胞中的 Jagged1 对泌乳和泌乳后退化并非必需。在肿瘤发生方面，Jagged1 在雄激素响应性管腔细胞中起肿瘤抑制作用，而在乳腺干细胞和管腔祖细胞中起肿瘤促进作用。这种亚型特异性作用在人类乳腺癌中也得到了验证，高 JAG1 表达与基底亚型乳腺癌患者生存率差相关，但与 ER+PR-HER2 - 肿瘤患者生存率好相关。

该研究的重要意义在于，首次明确了 Jagged1 在不同乳腺上皮细胞类型来源的乳腺癌中的相反作用，为深入理解乳腺癌的发生发展机制提供了新的视角。这一发现有助于开发基于 Jagged1 的亚型特异性治疗策略，为乳腺癌的精准治疗提供了潜在的新靶点。未来的研究可以进一步探讨 Jagged1 介导的 Notch 信号通路在不同乳腺癌亚型中的详细分子机制，以及如何针对这些机制进行靶向治疗，有望为乳腺癌患者带来更好的治疗效果和预后。