同种异体cd33定向CAR-NKT细胞治疗骨髓驻留性髓系恶性肿瘤

Yang及其同事此前报道了一种临床引导培养方法，通过改造人类造血干细胞和祖细胞来产生异体CAR-NKT细胞。作为潜在的应用，本文作者描述了异体cd33靶向CAR-NKT细胞的设计和特性，在骨髓常驻髓系恶性肿瘤的临床前模型中显示出抗肿瘤活性。

　　

新型免疫细胞疗法：异体 CD33 导向的 CAR-NKT 细胞治疗骨髓源性髓系恶性肿瘤

近日，加利福尼亚大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles）的研究人员在《Nature Communications》期刊上发表了题为 “Allogeneic CD33-directed CAR-NKT cells for the treatment of bone marrow-resident myeloid malignancies” 的论文。该研究开发出一种用于治疗骨髓源性髓系恶性肿瘤的新型免疫细胞疗法 —— 异体 CD33 导向的嵌合抗原受体自然杀伤 T 细胞（CAR-NKT）疗法，为髓系恶性肿瘤患者带来了新的希望，有望显著改善这类疾病的治疗现状。

研究背景

髓系恶性肿瘤，如急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS），主要发生于骨髓，严重干扰正常造血功能。目前，这类疾病的标准治疗方案包括强化化疗和异体干细胞移植，虽然有新的治疗方式如低甲基化药物（HMAs）等出现，但 AML 和 MDS 患者的 5 年生存率仍较低，分别为 37% 和 30%。治疗耐药的一个主要原因是骨髓中恶性原始细胞，尤其是白血病干细胞和祖细胞（LSPCs）持续存在，且骨髓微环境支持 LSPCs 存活和增殖，使其对化疗产生抗性。因此，开发针对骨髓中 LSPCs 的创新治疗方法迫在眉睫。

嵌合抗原受体（CAR）工程化 T 细胞（CAR-T）疗法在治疗多种血液恶性肿瘤和实体瘤方面展现出潜力，CD33 作为治疗髓系恶性肿瘤的潜在靶点备受关注。然而，传统 CAR-T 疗法存在诸多问题，如难以有效浸润骨髓和靶向 LSPCs，且多依赖自体 T 细胞，制造过程复杂、耗时、昂贵，不适用于健康 T 细胞不足或癌症进展迅速的患者。因此，开发一种通用的、现成可用的 CAR 工程化细胞产品意义重大。

自然杀伤 T 细胞（NKT）具有独特的免疫特性，其半不变的 T 细胞受体（TCR）能识别髓系恶性肿瘤细胞上丰富表达的非多态性 MHC I 类样分子 CD1d，且 NKT 细胞可通过 NKR 介导的杀伤作用靶向肿瘤细胞。此外，HMAs 可上调肿瘤细胞上的 CD1d 表达，与 NKT 细胞疗法可能存在协同效应。基于此，研究人员探索将 NKT 细胞工程化，开发出异体 CD33 导向的 CAR-NKT 细胞疗法，用于治疗髓系恶性肿瘤。

研究材料和方法

1. 样本采集：研究收集了 8 例原发性 AML 和 MDS 患者的骨髓样本用于流式细胞术分析，同时分析了两个公共单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集以研究转录组特征。此外，还获取了健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）、脐带血来源的 CD34 + 造血干细胞和祖细胞（HSPCs）等。
2. 细胞系构建：构建了多种细胞系，包括稳定表达萤火虫荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白双报告基因的 AML 细胞系（THP1-FG、KG1-FG、HL60-FG），以及敲除 CD33 或 CD1d 基因的细胞系（THP1-FGCD33-、THP1-FGCD1d-、THP1-FGCD33/CD1d-）。同时，构建了人工抗原呈递细胞系（aAPC）及其过表达 CD33 的细胞系（aAPC-CD33）。
3. CAR-NKT 细胞制备：采用临床指导的培养方法，将人类 HSPCs 基因工程与体外无饲养层培养相结合，通过慢病毒转导技术，将编码 iNKT TCR、CAR33 和可溶性人 IL-15 的基因导入 HSPCs，经过 5 个阶段、6 周的培养，生成异体 IL-15 增强的 CD33 导向的 CAR-NKT（Allo15CAR33-NKT）细胞。同时，制备了 PBMC 来源的常规 αβ T 细胞（PBMC-T）、CD33 导向的 CAR 工程化常规 αβ T 细胞（CAR33-T）及其 IL-15 增强的衍生物（15CAR33-T）作为对照。
4. 实验方法：运用多种实验方法评估 Allo15CAR33-NKT 细胞的性能，包括体外肿瘤细胞杀伤试验、体内动物实验（如异体移植 NSG 小鼠模型、人源化小鼠模型）、流式细胞术、ELISA、scRNA-seq、scTCR-seq、组织学分析等。

研究技术路线

1. CAR-NKT 细胞的生成：从脐带血获取 CD34+ HSPCs，通过慢病毒转导技术将相关基因导入细胞，随后在特定的 5 阶段、6 周无饲养层培养体系中诱导分化，最终生成 Allo15CAR33-NKT 细胞。在培养过程中，研究人员采用了不同的扩增策略，并对细胞的表型、功能和纯度进行监测。
2. 细胞功能和机制研究：使用多种 AML 细胞系和患者样本，通过体外肿瘤细胞杀伤试验，研究 Allo15CAR33-NKT 细胞的杀伤机制和疗效；利用流式细胞术分析细胞表面标记物和细胞内细胞因子、细胞毒性分子的表达；通过 scRNA-seq 和 scTCR-seq 深入探究细胞的基因组和分子特征。
3. 体内疗效和安全性评估：构建多种体内模型，如 AML 和 MDS 异体移植小鼠模型、人源化小鼠模型等，评估 Allo15CAR33-NKT 细胞的体内抗肿瘤疗效、骨髓归巢能力、安全性以及与 HMAs 联合治疗的协同效应。通过体内生物发光成像（BLI）、组织学分析、流式细胞术等技术对相关指标进行监测和分析。

研究结果

1. 原发性 AML 和 MDS 样本的生物标志物和转录组分析揭示 CAR-NKT 细胞疗法的潜力

研究人员通过对原发性 AML 和 MDS 骨髓样本进行流式细胞术和 scRNA-seq 分析，发现患者原始细胞存在不同亚群（LSCs、MPPs、CMPs 和 MBCs），且各亚群表面肿瘤抗原、NKT TCR 靶点和 NKR 配体的表达存在差异。LSCs 虽对治疗具有抗性，但高表达 NKR 配体，对 NKR 介导的杀伤敏感。综合分析结果表明，CAR-NKT 细胞疗法具有潜在的治疗价值。

2. 利用临床指导的培养方法可高效、高纯度地制备 HSPC 工程化异体 CAR33-NKT 细胞

采用既定方法，研究人员成功从人脐带血 CD34+ HSPCs 中生成 Allo15CAR33-NKT 细胞。在培养过程中，NKT 细胞比例逐渐增加，最终可达 99% 以上，且 CAR33 表达几乎为 100%，产量高。从单个脐带血供体的 HSPCs 可产生约 1012 个成熟的 Allo15CAR33-NKT 细胞，能满足大量患者的治疗需求。此外，研究还比较了单慢病毒载体和双慢病毒载体系统，发现两种系统均可有效生成 Allo15CAR33-NKT 细胞。与传统 CAR33-T 细胞相比，Allo15CAR33-NKT 细胞具有独特的表型，如 CD8 单阳性和双阴性表型，且不表达 CD33，可避免自相残杀。

3. 异体 CAR33-NKT 细胞具有显著的 NK 样特性和高细胞毒性功能

通过流式细胞术和 scRNA-seq 分析发现，Allo15CAR33-NKT 细胞具有典型的 NKT 细胞表型，表达高水平的 NK 标记物（如 CD56）、NKRs（如 NKG2D、DNAM-1 等）以及效应细胞因子（如 IFN-γ、TNF-α 等）和细胞毒性分子（如穿孔素、颗粒酶 B）。与传统 CAR33-T 细胞相比，Allo15CAR33-NKT 细胞具有更强的 T/NK 相关细胞毒性特征，在癌症治疗中具有潜在优势。

4. 异体 CAR33-NKT 细胞通过多种靶向机制高效杀伤 AML 和 MDS 肿瘤细胞

体外肿瘤细胞杀伤试验表明，Allo15CAR33-NKT 细胞可通过 CAR33、NKT TCR 和 NKR 介导的多种靶向机制，对不同抗原表达水平的 AML 肿瘤细胞均具有显著的杀伤作用。相比之下，CAR33-T 细胞仅对 CD33 + 肿瘤细胞有效，而 PBMC-T 细胞无明显杀伤作用。此外，Allo15CAR33-NKT 细胞在杀伤肿瘤细胞过程中，其激活标记物和细胞毒性分子的表达更高，具有更强的效应功能。

5. 异体 CAR33-NKT 细胞具有独特的骨髓归巢能力，由 CXCR4/CCR5 表达介导

在体内 PK/PD 研究中，通过 BLI 监测发现，Allo15CAR33-NKT/FG 细胞在 NSG 小鼠体内迅速扩增，具有较强的骨髓归巢能力，主要聚集在股骨、骨盆、肋骨和脊柱等部位。而传统 CAR33-T/FG 细胞虽也有扩增，但会导致严重的异种移植物抗宿主病（GvHD），且主要浸润在肺部、肝脏等器官，骨髓归巢能力较弱。进一步研究发现，Allo15CAR33-NKT/FG 细胞高表达 CXCR4 和 CCR5，这可能是其具有强骨髓归巢能力的原因。

6. 异体 CAR33-NKT 细胞可靶向髓系恶性肿瘤中骨髓驻留的白血病干细胞和祖细胞

在多种 AML 和 MDS 异体移植小鼠模型及原发性患者样本研究中，Allo15CAR33-NKT 细胞表现出强大的抗肿瘤疗效。在 THP1-FG、KG1-FG 和 HL60-FG 小鼠模型中，单次给药可使大多数小鼠肿瘤消除，实现长期生存；在 AML PDX 小鼠模型中，Allo15CAR33-NKT 细胞也能有效消除恶性原始细胞，延长小鼠生存时间。而 CAR33-T 细胞疗效有限，且会导致小鼠因肿瘤进展和 GvHD 死亡。此外，Allo15CAR33-NKT 细胞能够靶向并消除 CD33 阴性 / 低表达的 LSPCs，这是传统 CAR33-T 细胞无法做到的。

7. 异体 CAR33-NKT 细胞具有混合 T/NK 细胞特征、强大的效应 / 记忆功能和低耗竭的基因表达谱

通过建立体外肿瘤再挑战试验，对 Allo15CAR33-NKT 细胞进行 scRNA-seq 分析发现，其具有混合 T/NK 细胞表型，与 CAR33-T 细胞相比，具有更少的 T 细胞特征和更强的 NK 细胞特征。在肿瘤再挑战后，Allo15CAR33-NKT 细胞保持更好的功能，增殖和效应特征增强，耗竭特征显著降低，且具有更高的代谢能力，尤其是在糖酵解、氧化磷酸化和电子传递链活动方面。

8. 异体 CAR33-NKT 细胞可与低甲基化药物协同治疗

研究发现，HMAs（如地西他滨）可上调 AML 细胞系 THP1 细胞表面的 NKR 配体和 CD1d 表达，但对 CD33 表达无影响。体外肿瘤细胞杀伤试验表明，地西他滨处理后的 THP1 细胞对 Allo15CAR33-NKT 细胞的杀伤更敏感，且在体内联合治疗实验中，低剂量的 Allo15CAR33-NKT 细胞与地西他滨联合使用，可完全消除 THP1-FG 和 KG1-FG 小鼠模型中的肿瘤，使所有小鼠长期生存，显示出显著的协同效应。

9. 异体 CAR33-NKT 细胞安全性高，对造血前体细胞的脱靶效应极小

通过体外 HSPC 杀伤试验、HSPC 集落形成试验和体内 BLT 人源化小鼠模型实验，研究人员评估了 Allo15CAR33-NKT 细胞对造血前体细胞的安全性。结果表明，Allo15CAR33-NKT 细胞对造血前体细胞的集落形成无明显影响，在体内也未引起明显的体重变化和不良反应，且能有效杀伤 CD33 + 细胞，同时保留 CD33 - 细胞，显示出较高的安全性。

10. 异体 CAR33-NKT 细胞具有低 GvHD 风险、低 CRS 特征和抗宿主细胞介导的排斥反应

体外 MLR 试验和体内异体移植 NSG 小鼠模型实验表明，Allo15CAR33-NKT 细胞在体外诱导 IFN-γ 产生较少，在体内不会引发严重的 GvHD，且在肿瘤负荷重的小鼠模型中，引发的 CRS 相关生物标志物水平较低，显示出较低的 GvHD 风险和 CRS 特征。此外，通过体外 MLR 试验发现，Allo15CAR33-NKT 细胞对宿主细胞介导的 T 细胞和 NK 细胞的排斥反应具有抗性，可能与其表面 HLA-I、HLA-II 和 NK 细胞配体表达降低有关。

11. 异体 CAR33-NKT 细胞优于 IL-15 增强的传统 CAR33-T 细胞

在体外肿瘤细胞杀伤试验和体内 AML 异体移植小鼠模型实验中，比较了 Allo15CAR33-NKT 细胞、CAR33-T 细胞和 15CAR33-T 细胞的疗效和安全性。结果显示，Allo15CAR33-NKT 细胞在体外和体内均表现出最强的抗肿瘤能力，且安全性更高。接受 15CAR33-T 细胞治疗的小鼠出现了 CRS 和 GvHD 等不良反应，最终死亡，而接受 Allo15CAR33-NKT 细胞治疗的小鼠实现了无瘤长期生存。

研究结论

本研究成功开发出异体 CD33 导向的 CAR-NKT 细胞疗法，用于治疗骨髓源性髓系恶性肿瘤。该疗法具有诸多优势：能够高效、高纯度地制备 Allo15CAR33-NKT 细胞；细胞具有独特的骨髓归巢能力，可直接靶向骨髓中的恶性细胞；通过多种靶向机制，对 AML 和 MDS 肿瘤细胞，尤其是对传统疗法具有抗性的 LSPCs，具有显著的杀伤作用；与 HMAs 联合使用时，可产生协同效应，增强抗肿瘤疗效；安全性高，对造血前体细胞的脱靶效应极小，且具有低 GvHD 风险、低 CRS 特征和抗宿主细胞介导的排斥反应。综上所述，异体 CD33 导向的 CAR-NKT 细胞疗法在治疗髓系恶性肿瘤方面展现出巨大的潜力，为该领域的治疗提供了一种新的有效策略。

研究讨论

目前，传统 CAR-T 细胞疗法在治疗髓系恶性肿瘤方面虽有一定疗效，但面临制造困难、基因编辑复杂等问题；CAR-NK 细胞疗法虽有优势，但在细胞扩增、保存和体内持久性方面存在挑战。相比之下，NKT 细胞作为一种理想的细胞来源，具有独特的免疫特性，在肿瘤治疗中展现出潜力。本研究中，异体 CD33 导向的 CAR-NKT 细胞疗法利用 NKT 细胞的特性，结合 CAR 技术，为髓系恶性肿瘤的治疗带来了新的突破。

然而，该疗法仍面临一些挑战。尽管研究表明 Allo15CAR33-NKT 细胞对健康造血细胞群体影响较小，但由于 CD33 在髓系祖细胞和成熟髓系细胞上表达，可能存在潜在的骨髓抑制和中性粒细胞减少的风险。为解决这一问题，可考虑在细胞中引入自杀开关系统，增强其安全性。此外，作为异体来源的细胞产品，Allo15CAR33-NKT 细胞可能会在治疗窗口后被宿主细胞排斥，未来需要进一步研究如何延长其在体内的作用时间。

总体而言，本研究为髓系恶性肿瘤的治疗提供了一种创新且有前景的治疗方法，为后续的临床研究和应用奠定了坚实基础。未来研究可进一步优化该疗法，探索其在临床实践中的最佳应用方案，有望为广大髓系恶性肿瘤患者带来更好的治疗效果和生存希望。