Claudin-11通过干细胞因子调控免疫屏障形成和精原细胞增殖

CLDN11是免疫屏障形成所必需的，可以抑制精母细胞/精子抗原自身抗体的产生，并通过干细胞因子在小鼠中维持精原细胞的分化。

　　

探索 CLDN11 在睾丸免疫屏障与精子发生中的关键作用 —— 一项来自熊本大学的研究解读

2025 年，日本熊本大学（Kumamoto University）的 Taichi Sugawara 等人在《Communications Biology》期刊上发表了题为 “Claudin - 11 regulates immunological barrier formation and spermatogonial proliferation through stem cell factor” 的论文。该研究聚焦于睾丸中紧密连接蛋白 Claudin - 11（CLDN11），深入探讨其在免疫屏障形成以及精子发生过程中的重要作用机制，为理解男性生殖生理和相关疾病的发病机制提供了关键线索，在生殖医学领域具有重要意义。

一、研究背景

在人体中，上皮细胞形成的细胞层起着分隔体内外环境的屏障作用，其中紧密连接（TJs）位于上皮细胞侧膜顶端区域，通过限制溶质的细胞旁扩散，对上皮屏障功能至关重要。Claudins（CLDNs）是构成 TJ 链的主要跨膜蛋白，不同的 CLDN 蛋白在维持上皮极性和屏障功能方面发挥着特定作用。

在睾丸中，相邻支持细胞（Sertoli cells）之间形成的紧密连接（SCTJs）靠近生精小管基底膜，构建了血睾屏障。长期以来，人们认为 SCTJs 能将表达自身抗原的生精细胞与免疫系统隔离，形成免疫屏障，保护生精细胞免受自身免疫反应的攻击。然而，此前并没有直接证据证实 SCTJs 确实具备这一免疫屏障功能。

精子发生是一个复杂的过程，精原细胞分为 “未分化” 和 “分化” 两类。未分化精原细胞在生精小管基底室分化为前细线期精母细胞，随后跨越 SCTJs 进入管腔室进一步分化。干细胞因子（SCF）是维持分化精原细胞群体的关键分子，由 Sertoli 细胞分泌，对精原细胞的增殖和分化起着不可或缺的作用。但 SCF 在 Sertoli 细胞表面的分布及定位调控机制尚不明确。

二、研究材料与方法

（一）实验动物

研究使用了多种小鼠品系，包括 Cldn11 基因敲除小鼠（Cldn11-/-）、Rag2 基因敲除小鼠（Rag2-/-） 、Cldn11/Rag2 双基因敲除小鼠（Cldn11-/-/Rag2-/-） 以及野生型小鼠等。其中，Cldn11-/- 小鼠由 M. Furuse 提供，Rag2-/- 小鼠从熊本大学动物资源与发展中心获得。实验小鼠均在特定条件下饲养，实验方案经过熊本大学动物护理和使用委员会批准，确保符合动物伦理规范。

（二）细胞培养与载体构建

实验采用了 L 细胞、MDCK II 细胞和 HEK 293 细胞。细胞在添加 10% 胎牛血清的杜氏改良 Eagle 培养基中，于 37°C、5% CO?条件下培养。通过 PCR 扩增目的基因，将编码小鼠 CLDN11 和 SCF 的 cDNA 片段克隆到表达载体中，用于细胞转染和蛋白表达研究。

（三）实验技术

1. 组织学与免疫组化：对睾丸组织进行固定、脱水、石蜡包埋，制作切片后进行苏木精 - 伊红染色和免疫组化染色。免疫组化染色前需进行抗原修复，利用多种特异性抗体标记不同的细胞和蛋白，以观察睾丸组织的形态结构、细胞类型分布以及蛋白表达和定位情况。
2. 全组织免疫荧光：分离小鼠睾丸的生精小管，去除间质细胞后进行固定、通透和封闭处理，与特异性抗体孵育，然后使用共聚焦激光扫描显微镜观察，获得 Z 轴堆叠图像并进行处理分析。
3. 示踪实验：向小鼠睾丸间质注射标记物，如 EZ - link Sulfo - NHS - LC - Biotin 或 CF488A - 共轭 150 kDa 可固定葡聚糖，之后对睾丸组织进行处理制作切片，观察标记物的扩散情况，以此评估 Sertoli 细胞屏障功能。
4. 透射电镜：固定睾丸组织，经过一系列处理后制作超薄切片，使用透射电镜观察 SCTJs 的超微结构。
5. 蛋白质免疫印迹：提取睾丸组织蛋白，进行 SDS - PAGE 电泳分离，转膜后与特异性抗体孵育，利用化学发光法检测蛋白表达水平。
6. GST 下拉实验：在大肠杆菌中表达 GST 或 MBP 融合蛋白，通过与相应树脂结合、洗脱等步骤，进行体外结合实验，验证蛋白之间的相互作用。
7. 生物信息学分析：获取成年人类和小鼠生精细胞的单细胞 RNA 测序数据，使用 Loupe Browser 重新分析基因表达水平。

三、研究结果

（一）CLDN11 对小鼠精子发生至关重要

通过对 Cldn11 基因敲除小鼠的研究发现，与对照小鼠相比，Cldn11-/- 小鼠睾丸体积更小、重量减轻。组织学和免疫组化分析显示，Cldn11-/- 小鼠睾丸精子发生受损，附睾中精子数量减少。进一步使用生精细胞标记物进行免疫组化检测，发现 Cldn11-/- 小鼠中分化精原细胞（KIT 阳性）数量显著减少，而未分化精原细胞（GFRA1、PLZF、LIN28A 阳性）数量受影响较小。TUNEL 实验表明，Cldn11-/- 小鼠生精小管中凋亡细胞数量增加，且主要发生在精母细胞（DDX4 阳性、SCP3 阳性）中。这些结果表明，CLDN11 对成年小鼠稳态精子发生至关重要，其缺失会导致精子发生缺陷。

在研究 CLDN11 在精子发生第一波过程中的作用时，发现野生型小鼠在出生后 10 天（P10）时，CLDN11 和 ZO1 信号在生精小管内，但未在基底膜附近积累；到 P20 和 P30 时，两者在基底膜附近共定位，表明 SCTJs 在 P10 - P20 期间形成。Cldn11-/- 小鼠在 P20 和 P30 时出现睾丸组织学异常，如支持细胞聚集，且 P30 时未观察到细长精子，而对照小鼠有。这说明 CLDN11 介导的 SCTJ 形成对完成精子发生第一波是必要的，但对其起始并非必需。

（二）CLDN11 对 SCTJ 形成和 Sertoli 细胞屏障功能不可或缺

对 Cldn11 基因敲除小鼠生精小管中 TJ 相关蛋白定位的研究发现，虽然 OCLN 和 ZO1 仍在基底膜附近共定位，但 JAM1 与 ZO1 的共定位减少，CLDN3 与 ZO1 的部分共定位在 Cldn11-/- 小鼠中消失，CLDN5 信号在野生型和 Cldn11-/- 小鼠生精小管中均不明显。全组织免疫荧光显示，Cldn11-/- 小鼠生精小管中 ZO1 定位不连续且碎片化。体外实验表明，CLDN11 能通过其 PDZ 结合基序（HV 序列）直接与 ZO1 的 PDZ1 结构域结合，调控 ZO1 定位。

透射电镜结果显示，Cldn11-/- 小鼠 Sertoli 细胞相邻质膜间的紧密接触消失，出现较大间隙。示踪实验表明，Cldn11-/- 小鼠中生物素化试剂能扩散至生精小管管腔室，而对照小鼠中则在 ZO1 阳性的 SCTJs 处停止扩散。这些结果表明，CLDN11 对 SCTJ 形成和 Sertoli 细胞屏障功能至关重要。

（三）CLDN11 可防止针对精母细胞 / 精子细胞抗原的自身抗体产生及 IgG 渗透

免疫组化检测发现，Cldn11-/- 小鼠血清中针对精母细胞 / 精子细胞抗原的自身抗体阳性率显著高于对照小鼠。蛋白质免疫印迹结果也证实了 Cldn11-/- 小鼠血清中存在针对睾丸抗原的自身抗体。免疫组化观察 IgG 分布发现，在 Cldn11+/- 小鼠中，IgG 定位于 CLDN11 阳性的 SCTJs 外，而在 Cldn11-/- 小鼠中，IgG 在生精小管管腔室积累。示踪实验显示，Cldn11-/- 小鼠中 150 kDa 葡聚糖从间质向管腔室的通量增加，表明 CLDN11 可形成对 IgG 等大分子的物理屏障。同时，研究发现 CLDN11 对防止白细胞浸润到生精小管并非必需。

（四）Rag2 基因敲除不能恢复 Cldn11 基因敲除导致的精子发生缺陷

为探究 CLDN11 是否通过抑制针对生精细胞的体液免疫反应促进精子发生，研究人员构建了 Cldn11/Rag2 双基因敲除小鼠。结果显示，Cldn11-/- 和 Cldn11-/-/Rag2-/- 小鼠睾丸大小和重量均小于对照小鼠，且两者之间无显著差异。双基因敲除小鼠睾丸组织学异常，附睾中无精子，与 Cldn11-/- 小鼠相似。这表明 CLDN11 介导的精子发生独立于 RAG2 功能，针对生精细胞的体液和细胞免疫反应不是 Cldn11-/- 小鼠精子发生缺陷的原因。

（五）CLDN11 有助于 Sertoli 细胞极化和细胞连接成分定位

通过对用白消安处理去除生精细胞的小鼠睾丸进行免疫组化分析，发现 Cldn11-/- 小鼠 Sertoli 细胞极性异常。顶端标记物 Ezrin 在 Cldn11+/- 小鼠中位于管腔室，而在 Cldn11-/- 小鼠中错误定位于基底膜附近；基底外侧标记物 Na/K - ATPase α1 亚基（ATP1A1）在 Cldn11+/- 小鼠中定位于基底外侧膜，在 Cldn11-/- 小鼠中则在管腔和基底区域弥散分布。此外，Cldn11 基因敲除还影响了黏附连接蛋白 Nectin - 2 和间隙连接蛋白 GJA1 在生精小管中的定位。这些结果表明，CLDN11 有助于 Sertoli 细胞极化和细胞连接成分在 Sertoli 细胞 - Sertoli 细胞接触处的定位。

（六）CLDN11 通过 SCF 促进分化精原细胞增殖

研究利用缺乏跨膜形式 SCF 的 Sl/Sl 突变小鼠，证实跨膜形式的 SCF 对维持分化精原细胞是必要的。免疫组化分析发现，在白消安处理的睾丸中，SCF 在 Cldn11+/- 小鼠中与 TJ 标记物在基底膜附近紧密共定位，而在 Cldn11-/- 小鼠中从 Sertoli 细胞 - Sertoli 细胞连接处错误定位。向 Cldn11-/- 小鼠睾丸间质移植 SCF 浸泡的凝胶珠后，发现靠近 SCF 浸泡珠的生精小管中 KIT 阳性细胞密度显著增加，而对照的 BSA 浸泡珠则无此效果。这表明 CLDN11 通过调节 SCF 定位，促进分化精原细胞增殖。

四、研究结论与讨论

（一）研究结论

1. 本研究首次直接证明了 CLDN11 在 SCTJ 形成和免疫屏障功能中的关键作用。Cldn11 基因敲除导致小鼠产生针对精母细胞 / 精子细胞抗原的自身抗体，表明 CLDN11 可限制生精小管管腔室自身抗原泄漏，抑制自身抗体产生；同时，CLDN11 还能阻止 IgG 等大分子渗透进入生精小管，发挥免疫屏障功能。
2. 研究发现 CLDN11 介导的精子发生不依赖于对生精细胞免疫反应的抑制。Rag2 基因敲除虽消除了适应性免疫反应，但不能恢复 Cldn11 基因敲除小鼠的精子发生缺陷，表明其他机制在 Cldn11 基因敲除导致的精子发生异常中起主要作用。
3. 揭示了 CLDN11 通过促进 Sertoli 细胞极化，调控 SCF 在生精小管基底室的定位，进而维持分化精原细胞的增殖。CLDN11 的缺失导致 SCF 定位异常，分化精原细胞数量减少，影响精子发生过程。

（二）讨论

经典观点认为 SCTJs 形成免疫屏障保护生精细胞，但此前缺乏直接证据。本研究通过对 Cldn11 基因敲除小鼠的研究，为 SCTJs 的免疫屏障功能提供了有力支持。同时，研究还发现 CLDN11 在调节 Sertoli 细胞极性和 SCF 定位方面的新功能，为理解精子发生的调控机制提供了新视角。

然而，本研究也存在一些局限性。例如，虽然发现 CLDN11 可防止自身抗体产生，但具体机制尚未完全明确，Cldn11 基因敲除对 Sertoli 细胞中 TGF - β 表达和调节性 T 细胞功能的影响有待进一步研究。此外，研究主要在小鼠模型中进行，其结果在人类中的适用性还需进一步验证。

总体而言，该研究重新审视了 SCTJ 介导的生精细胞免疫屏障的经典概念，为深入理解精子发生过程中 CLDN11 的作用提供了重要依据，对男性生殖医学的基础研究和相关疾病的治疗具有重要的理论指导意义，有望为未来男性不育症的诊断和治疗开辟新的方向。