缺氧肾损伤时，人近端小管上皮细胞白介素-1受体信号触发G2/M阻滞和细胞衰老

　　

缺氧与 IL-1β 协同诱导人近端肾小管上皮细胞衰老：慢性肾脏病治疗新靶点探索

来自昆士兰大学医学院等多个单位的研究人员，在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Human proximal tubular epithelial cell interleukin-1 receptor signalling triggers G2/M arrest and cellular senescence during hypoxic kidney injury” 的论文。该研究揭示了缺氧与白细胞介素 - 1β（IL-1β）在慢性肾脏病（CKD）进程中，协同诱导近端肾小管上皮细胞（PTEC）衰老的机制，为 CKD 的治疗和诊断提供了新的靶点与思路，对推动 CKD 精准治疗发展意义重大。

一、研究背景

近年来，CKD 全球负担急剧上升，老龄化、糖尿病和高血压患病率增加是主要诱因。肾小管间质纤维化是 CKD 的病理标志，由持续炎症和缺氧微环境中肾小管细胞不可逆损伤引发。PTEC 是 CKD 中关键的肾小管细胞群体，依赖线粒体脂肪酸氧化供能，使其易受缺氧炎症微环境影响。缺氧时，PTEC 会发生铁死亡并诱导 IL-1β 产生，而 IL-1β 在纤维化肾脏中水平升高，可与 PTEC 上的 IL-1 受体 I 型（IL-1RI）结合，影响 CKD 进程。然而，目前对缺氧联合 IL-1β/IL-1RI 信号对 PTEC 的复杂影响知之甚少。

二、研究材料与方法

1. 细胞与组织样本获取：从肿瘤肾切除术患者（无高血压和糖尿病合并症）的健康肾皮质组织中获取样本，经医院伦理委员会批准并取得患者知情同意。根据间质纤维化程度将样本分为非纤维化（对照）和纤维化组，用于后续实验。
2. PTEC 的分离与培养：从非纤维化肾皮质组织中分离培养人原代 PTEC，采用特定方法纯化后在定义培养基（DM）中培养，实验所用细胞为第 4 代。
3. 实验处理：将 PTEC 培养至 70 - 80% 融合后，分别在常氧（21% O?）或缺氧（1% O?）条件下，添加或不添加 1 ng/ml 重组人 IL-1β 处理 24 - 72 小时，用于不同检测分析。
4. 检测方法：运用批量 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达谱；通过蛋白质印迹和流式细胞术检测蛋白表达和细胞周期；采用 MTT 法检测细胞增殖；利用衰老相关 β - 半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老；对肾脏组织进行免疫荧光（IF）染色，观察 IL-1RI 和 SA-β-gal 表达；通过流式细胞术分析尿 PTEC。
5. 数据分析：样本量依据以往类似实验确定，数据以相对于对照条件（常氧 + 载体）的倍数变化进行归一化处理。使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 多重比较后检验，非配对组比较用 Welch’s t 检验，Spearman 相关性分析用于探究尿 PTEC 数量与相关指标的关系，P≤0.05 为差异有统计学意义。

三、研究结果

1. 缺氧炎症条件下 PTEC 上调 IL-1RI 表达：研究人员将患者来源的 PTEC 在不同氧浓度和 IL-1β 存在与否的条件下培养，通过流式细胞术和蛋白质印迹分析发现，缺氧联合 IL-1β 处理的 PTEC 中，IL-1RI 蛋白表达显著增加，而 IL-1RII 表达极少或无。这表明缺氧与 IL-1β 协同作用可上调 IL-1RI 表达，增强 PTEC 对 IL-1β 刺激的敏感性。
2. 缺氧炎症条件下 PTEC 的转录组变化：对四组 PTEC 进行 RNA-seq 分析，主成分分析显示样本主要依据氧条件和处理组分离。对比缺氧 + IL-1β 与常氧 + 载体处理的 PTEC，发现 2041 个差异表达基因（DEGs），其中 692 个为 “独特” DEGs。对 “独特” 上调 DEGs 进行 KEGG 通路富集分析，发现丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等四条通路显著富集；对 “独特” 下调 DEGs 分析，发现细胞周期通路等三条通路显著富集，且细胞周期通路中关键基因（如 CCNA2、CCNB1 和 CCNB2）表达下调，这表明缺氧炎症条件下 PTEC 细胞周期相关基因表达受到显著影响。
3. PTEC 衰老由 IL-1RI 信号介导：MTT 实验表明，缺氧联合 IL-1β 处理的 PTEC 细胞增殖显著降低，基因集富集分析显示 “衰老” 相关基因集在该条件下显著富集。进一步研究发现，缺氧 + IL-1β 处理使 PTEC 更多地停滞在 G2/M 期，p21 和 SA-β-gal 活性升高。添加 IL-1RI 中和抗体或使用槲皮素 + 达沙替尼（Q + D）组合处理，可降低 SA-β-gal 活性，减少衰老细胞负担，同时发现缺氧 + IL-1β 处理的 PTEC 培养上清中促炎和促纤维化的衰老相关分泌表型（SASP）因子（如 TGF-β1、MCP - 1 和 IL-6）水平升高，这些结果表明缺氧与 IL-1β 通过激活 IL-1RI 信号介导 PTEC 衰老。
4. 纤维化肾脏中 PTEC 的变化：对纤维化肾脏组织进行 IF 染色，发现 PTEC 中 IL-1RI 表达和 SA-β-gal 活性显著高于非纤维化组织，定量分析进一步证实了这一结果，表明 PTEC 的 IL-1RI 表达和衰老与肾小管间质纤维化的发生发展相关。
5. 肾小管间质纤维化患者尿 PTEC 的变化：收集肾活检患者尿液样本，经流式细胞术分析发现，纤维化组尿白细胞和尿 PTEC 数量显著高于非纤维化组，且尿 IL-1β 水平也显著升高。对尿 PTEC 进行衰老表型分析，发现纤维化组 SA-β-gal?尿 PTEC 数量、比例和荧光强度均显著增加，与衰老相关的标记物 CD26?尿 PTEC 也有类似变化。此外，SA-β-gal?尿 PTEC 数量和荧光强度与间质纤维化程度、尿 IL-1β 水平呈正相关，与患者肾功能（eGFR）无显著相关性，这表明肾小管间质纤维化患者尿液中可检测到更多衰老的 PTEC，为非侵入性检测 CKD 提供了潜在依据。

四、研究结论与讨论

本研究表明，缺氧和 IL-1β/IL-1RI 信号协同作用，通过使 PTEC 细胞周期停滞在 G2/M 期诱导细胞衰老，并激活潜在的促纤维化（TGF-β1/TGFβR1）信号级联反应，促进肾小管间质纤维化，推动 CKD 进展。研究首次在人 CKD 中提供了体内外证据，证实了 PTEC 衰老与 IL-1β/IL-1RI 信号在缺氧炎症微环境中的关联。

在 CKD 进程中，缺氧损伤促使 PTEC 释放危险信号，激活髓样细胞释放 IL-1β，IL-1β 与 PTEC 上的 IL-1RI 结合，引发一系列细胞内变化，导致细胞衰老和纤维化相关信号通路激活。实验小鼠模型研究虽已将 IL-1β/IL-1R 信号与肾小管细胞衰老联系起来，但本研究进一步明确了在人原代 PTEC 中的具体机制。同时，研究验证了 Q + D 药物组合对缺氧 + IL-1β 处理的 PTEC 的衰老清除效果，为未来开发新型抗衰老疗法提供了可靠模型。

此外，研究发现纤维化肾脏组织中 SA-β-gal? PTEC 增加，且尿中衰老 PTEC 数量与 CKD 严重程度相关，这为 CKD 的非侵入性诊断和病情监测提供了新的潜在生物标志物。基于尿 PTEC 的流式细胞术检测有望发展成为一种实时评估 CKD 纤维化程度和治疗效果的有效手段。

总体而言，该研究揭示了 CKD 中先天免疫与 PTEC 衰老之间的复杂信号回路，为 CKD 的精准治疗开辟了新途径。未来可进一步探索针对缺氧和 IL-1RI 信号的联合治疗策略，评估其在临床实践中的可行性和有效性。同时，深入研究尿 PTEC 作为生物标志物的临床应用价值，有望为 CKD 患者提供更早期、更精准的诊断和治疗方案，改善患者预后。